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PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 经典PCR循环参数（500bp以内） 4. 巢式PCR（nested PCR） 是指利用两套PCR引物（巢式引物）对进行两轮PCR扩增反应。  在第一轮扩增中，外引物用以产生扩增产物，此产物在内引物的存在下进行第二轮扩增。 巢式PCR的优缺点 由于巢式PCR反应有两次PCR扩增，从而降低了扩增多个靶位点的可能性（因为与两套引物都互补的引物很少）增加了检测的敏感性；又有两对PCR引物与检测模板的配对，增加了检测的可靠性。  　一般应用于动物方面。如：病毒，梅毒螺旋体，HIV，肿瘤基因等 巢式PCR，可以在10的六次方基因组背景下检测到一个拷贝的病毒基因，也不像二次PCR容易产生成片的产物，是效果最好的PCR，但也因此是最容易污染的PCR （1）RT-PCR的意义 修饰 剪切 拼接等 mRNA的加工 5`-端加上帽子结构3`-端添加Poly A 切除内含子 内含子：许多真核生物的基因是不连续的。有些DNA序列虽然能被转录成RNA，但在加工过程中又被切除，这些片段，称内含子。 外显子：能够被转录为RNA，并能翻译出蛋白质的DNA序列。 （1）RT-PCR扩增原理： A. 在单引物的介导下和逆转录酶的催化下，合成RNA的互补cDNA，加热后cDNA与RNA链解离； B. RNA复制酶是以RNA为模板，合成新链的方向：5`→3` C. 然后与另一引物退火，并由DNA聚合酶催化引物延伸生成双链靶DNA， 最后扩增靶DNA. RT－PCR的步骤: 从细胞中分离mRNA 将mRNA逆转录成cDNA 这个步骤与转录是相反的，因此叫逆转录－逆转录酶来源于病毒 逆转录后，获得了一些微量的cDNA, 这些微量的cDNA还不足以用来测序。 因此，需要将这些微量的cDNA扩增足够的拷贝才能用于序列测定或基因操作。 9.实时定量PCR简介 电泳分离不同大小的DNA片断 转录终止的发夹结构 Denaturation Annealing Extension 5’ Exonuclease Activity 三、PCR技术的应用 1.基因克隆 重组DNA 质粒DNA 基因片段 5’ 5’ Bam H I Bam H I Bam H I Bam H I 2.基因检测 A’ 内源性病变基因 正常人 A 病 人 病原微生物基因 正常人 (-) 病 人 (+) 遗传病的诊断 基因缺失、插入或置换等 地中海贫血 珠蛋白链合成不平衡 A 正常人 病 人 正常 病人 3.基因鉴定 女性 男性 Y引物 PCR 男性 女性 （2）引物浓度 0.1-0.5 ?mol/L 浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降。 （3）Taq DNA聚合酶 0.5-2.5 U/50 ?l 酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。 （4）dNTP dNTP浓度取决于扩增片段的长度 四种dNTP浓度应相等 浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则降低反应产量 dNTP可与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度下降，影响DNA聚合酶的活性。 （5） Mg2+ Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。 0.5mmol/L-2.5mmol/L反应体系。 Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降； Mg2+过高影响反应特异性。 2.循环参数 变性 使双链DNA解链为单链 95oC 20-30秒 (2) 退火 温度由引物长度和GC含量决定。 增加温度能减少引物与模板的非特异性结合;降低温度可增加反应的灵敏性。 （3）延伸 70-75oC 延伸时间由扩增片段长度决定 （4）循环次数 主要取决于模版DNA的浓度，一般为25-35次 次数过多：扩增效率降低，错误掺入率增加 三、PCR的类型和应用 研究 基因克隆，DNA测序，分析突变 诊断 细菌、病毒、寄生虫检测，诊断 人类基因组工程 遗传图谱的构建，DNA测序，表达图谱 法医 犯罪现场标本分析 肿瘤 各种肿瘤检测 其他…… 1.不对称PCR 目的：扩增产生特异长度的单链DNA。 方法：采用两种不同浓度的引物。分别称为限制性引物和非限制性引物,其最佳比例一般是0.01∶0.5μM,关键是限制性引