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抗体制备技术 临床免疫学教研室 李会强 教授 引言 引言 引言 应用领域 引言 引言 高质量的抗体应该具有高效价、高特异性及高亲和性。 制备高质量抗体就必须有理想的免疫原，适宜的动物和制定最佳的免疫方案。 制备免疫原 何谓免疫原？ 免疫原（immunogen)指用于制备抗体的抗原(antigen)或半抗原(hapten）； 免疫原包括颗粒性抗原、可溶性抗原和人工修饰的抗原； 制备颗粒性免疫原 颗粒性免疫原包括： 细胞性抗原：血细胞和组织细胞 病原体：细菌、病毒、支原体等 制备绵羊红细胞 制备细菌性免疫原 制备可溶性免疫原 制备可溶性免疫原 制备可溶性免疫原 层析技术 层析柱 紫外监测 收集器 制备可溶性免疫原 免疫原的鉴定 纯度 蛋白含量 免疫活性 分子量 制备人工免疫原 人工免疫原 经过人工修饰的半抗原称之为人工免疫原。如：甾体类激素、小分子药物等。 将半抗原与蛋白载体连接，使之具有免疫原性，可用于制备免疫血清。 制备人工免疫原 用于连接的载体 蛋白质类：白蛋白 多肽聚合物：多聚赖氨酸 大分子聚合物：羧甲基纤维素 制备人工免疫原 修饰半抗原是需考虑： 半抗原的溶解度和稳定性 ; 结合键的位置 ; 选择适合的偶联试剂； 制备人工免疫原 含有氨基或羧基的半抗原与载体连接方法： 碳化二亚胺法 混合酸酐法 戊二醛法 制备人工免疫原 不含有氨基或羧基的半抗原需改造成带有上述基团的衍生物，再通过上述方式连接： 琥珀酸酐法可将带有羟基的半抗原改造成带羧基的半抗原。 制备人工免疫原 一般情况下： 人工免疫原的制备是一个重要和复杂的工作； 一种半抗原需同时连接两种不同载体，便于半抗原抗体的检测； 关于佐剂的使用 何谓“佐剂” 佐剂（adjuvant）是指能够增强免疫 应 答或 改变 免疫应答类型的物质，应用时可与抗原同时或预先注射于机体。佐剂本身可以有免疫原性，也可以没有免疫原性。 关于佐剂的使用 佐剂种类： 具有免疫原性 抗酸杆菌（BCG） 无免疫原性 福氏佐剂 氢氧化铝 福氏佐剂 成分： 羊毛脂 液体石蜡 BCG 福氏佐剂 使用原则： 颗粒性抗原一般情况下不需使用； 可溶性大分子量的蛋白质免疫原、人工抗原，初次免疫时必须使用佐剂； 不连续两次使用完全福氏佐剂，以免导致动物严重反应； 制备福氏佐剂-可溶性抗原复合物 选择动物与免疫动物 免疫血清与多克隆抗体 制备免疫血清的程序 如何选择免疫动物 原则： 免疫原与动物种属关系 ； 动物个体状况的选择； 抗原性质与动物种类 ； 抗血清用量和要求 ； 如何选择免疫动物 动物饲养 免疫方案 免疫方案之一：全量免疫法 免疫方案之二：微量免疫法 测试抗体与动物放血 如何测定抗体效价 颗粒性抗原 免疫原性强，抗体效价高，可采用凝集实验测定。 可溶性抗原 采用沉淀反应或其它标记免疫技术测定。 如何测定抗体效价 制备单克隆抗体的理论基础 克隆选择学说 1857年，FM Burnet提出克隆选择学说。指出：每个B淋巴细胞表面的抗原受体只识别一种抗原表位，并产生针对该决定簇的抗体。 克隆选择学说 克隆选择学说 杂交瘤技术 杂交瘤技术的创始人 杂交瘤技术 杂交瘤技术的基本原理 两个基本问题 亲本细胞之一：免疫脾细胞 被抗原致敏的B淋巴细胞，可分化为浆细胞并分泌免疫球蛋白； 单一B细胞克隆表达一种抗原受体，识别并结合一种抗原表位，分泌单一特异性抗体； 亲本细胞之一：免疫脾细胞 亲本细胞之二：骨髓瘤细胞 选择有HGPRT或TK缺陷的细胞株； 能与B细胞杂交形成稳定的杂交瘤细胞，并分泌免疫球蛋白； 骨髓瘤细胞本身不分泌免疫球蛋白； 具有较高融合效率； 亲本细胞之二：骨髓瘤细胞 容易培养传代，一般培养基即可，无特殊要求。 亲本细胞之二：骨髓瘤细胞 细胞融合 细胞融合 化学法 物理法 生物法 选择培养基 基本成分 次黄嘌呤（H） 氨基蝶吟（A） 胸腺嘧啶（T） 选择培养基作用原理 选择培养基作用原理 选择培养基作用原理 杂交瘤技术的实验流程 实验流程 实验流程 实验流程 技术要点 免疫脾细胞的制备 骨髓瘤细胞的培养与筛选 细胞融合 阳性克隆的筛选 克隆化 大量抗体的制备 制备脾细胞 选择合适的免疫方案是获得高质量的抗体的前提； 一般要在融合前两个月左右确立免疫方案开始初次免疫； 免疫方案应根据抗原的特性不同而定； 制备脾细胞 培养筛选骨髓瘤细胞 SP2/0细胞为肿瘤细胞，易发生突变丧失酶的缺陷； 为确保SP2/0细胞对HAT的敏感性，每3～6月应用8-AG(8氮鸟嘌呤)筛选一次，以防止细胞的突变； 培养筛选骨髓瘤细胞 培养筛选骨髓瘤细胞 使用对数生长期细胞，融合前进行换液，确保细胞处于最佳状态。 培基：RPMI1640，DMEM培养基。小牛血清的浓度一般在10～20％ 。 一般在准备融合前