地衣芽孢杆菌复配苯噻酮菌株对脐橙溃疡病作用机理与控病研究.doc

地衣芽孢杆菌复配苯噻酮菌株对脐橙溃疡病作用机理与控病研究 　　摘 要： 系统研究了地衣芽孢杆菌复配苯噻酮菌株对溃疡病病菌生长的影响，对其拮抗因子几丁质酶及β-1，3葡聚糖酶活性进行分析，进而进行了其离体果控病试验及田间防治试验。结果表明，有益微生物地衣芽孢杆菌复配苯噻酮对脐橙溃疡病有明显的抑菌作用，可造成溃疡病菌菌丝中空、扭曲、破损，地衣芽孢杆菌复配苯噻酮菌株可以分泌几丁质酶及β-1，3葡聚糖酶抑制病菌生长，在发病前或发病初期喷布地衣芽孢杆菌复配苯噻酮对脐橙溃疡病有较好的防治作用。 　　关键词： 脐橙溃疡病；地衣芽孢杆菌；苯噻酮；作用机理；控病 　　脐橙溃疡病是脐橙生产上的重要病害，目前多采用化学农药进行防治，化学农药使用量越来越大，农药残留有加重的趋势[1]。利用有益微生物来调控该病，可减少防治脐橙溃疡病的化学农药使用量，降低农药污染，改善环境，提高脐橙产品质量[2]。开展有益微生物的抑菌作用机理与控病研究可为地衣芽孢杆菌复配苯噻酮的产业化提供科学依据。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　脐橙溃疡病病菌为本研究室保存。地衣芽孢杆菌复配苯噻酮菌株发酵液制备：将本研究室保存的地衣芽孢杆菌复配苯噻酮菌株悬液接种到NA培养液中，摇瓶发酵培养3d，保存备用。 　　1.2 地衣芽孢杆菌复配苯噻酮菌株对溃疡病病菌生长的影响 　　1.2.1 试验设计。试验设4种处理方法：①将溃疡病病菌孢子接种到装有5ml复配苯噻酮的地衣芽孢杆菌溶液的试管中，空白对照是含葡萄糖的无菌水，置于28℃下培养3d，显微镜下观察病菌生长状况。②用接种针分别挑取地衣芽孢杆菌复配苯噻酮和溃疡病病菌菌碟放到NA培养基上，进行对峙试验，在28℃下培养4d后观察结果。③挑取沾有地衣芽孢杆菌发酵液复配苯噻酮的纸碟放到含有溃疡病菌的NA培养基上，28℃下培养4d后观察抑菌结果。④将地衣芽孢杆菌菌株发酵液放到高压蒸汽灭菌锅内，121℃灭菌20min，灭活后的菌株采用和②相同的处理方法。 　　1.2.2 地衣芽孢杆菌复配苯噻酮菌株对溃疡病病菌生长作用的显微观察。取地衣芽孢杆菌复配苯噻酮和溃疡病菌对峙试验交合处，用双面胶带粘样，用IB-5型离子溅射仪喷镀，厚度为200A，在日立S-450扫描电子显微镜下观察并照相。 　　1.3 地衣芽孢杆菌发酵液复配苯噻酮拮抗因子分析 　　1.3.1 酶粗提液制备。挑取保存的地衣芽孢杆菌菌株在NA平板上活化培养3d，用10ml无菌水洗下制成菌悬液，取500μl菌悬液接种于无菌的 NA液体培养中，28℃下150r/min震荡培养。分别于接种培养后的1d、2d、3d、4d、5d、6d、7d、8d、9d、10d取样，将样品在10000r/min下4℃离心20min，取上清液为酶粗提液，4℃保存备用。 　　1.3.2 N-乙酰氨基葡萄糖胺标准曲线测定。将500μg/ml的N-乙酰氨基葡萄糖胺准确稀释至100μg/ml，用此溶液再稀释成不同浓度（起始浓度为0μg/ml）。然后取几支干净试管，分别加入不同浓度的N-乙酰葡萄糖胺溶液1.5ml、高铁氰化钾溶液2ml，置于100℃水浴中15min，冷却，于420nm处以蒸馏水为空白对照读取光密度值。光密度值的下降与糖浓度成反比。以光密度为纵坐标，N-乙酰葡萄糖胺浓度为横坐标绘制标准曲线。 　　1.3.3 几丁质酶活性。参照Boller等方法[1]，将几丁质用稀盐酸溶解，再以碱溶液中和，最后用0.1M醋酸钠缓冲液（pH=5.2）定容。取定量的酶粗提液与底物溶液混合，在37℃条件下恒温水浴反应2h。反应结束后，10000rpm离心5min，取上清液0.5ml，加入3%蜗牛酶2ml和pH值7.1的磷酸钠缓冲液，37℃水浴1h，加100μl四硼酸钾（pH=9.1），煮沸3min，冷却后加入2ml DMAB，37℃保温20min，立即冷却，在585nm下测OD值。以N-乙酰葡萄糖胺作标准曲线。以每小时分解几丁质产生1μg的N-乙酰葡萄糖胺的酶量为一个酶活单位（U）。 　　1.3.4 标准还原糖曲线制作。将500μg/ml的葡萄糖溶液准确稀释成不同浓度的葡萄糖溶液，然后取干净试管分别加入不同浓度的葡萄糖溶液0.5ml，加入0.5ml铜制剂，置于沸水浴中10min，之后用自来水冷却。加入0.5ml砷钼酸试剂，混匀，再加入3.5ml蒸馏水，在分光光度计660nm处测定光密度值，以光密度值为横坐标、葡萄糖浓度值为纵坐标制作标准曲线。 　　1.3.5 β-1，3葡聚糖酶活性测定。取定量的酶粗提液，用DNS法测定所形成的还原糖量，以每秒产生还原糖1μmol的酶量为一个酶活单位（U）。 　　1.4 地衣芽孢杆菌复配苯噻酮的离体果控病试验 　　在田间选取大小、成熟度基本一致的脐橙果实，按下述3种方式处