胶质瘤侵袭性生长与基质金属蛋白酶2及其抑制物关系的研究课件.pptVIP

胶质瘤标本来源、病理确诊、分级标准、标本切除、处理方法及对照标本均同实验二 用酶谱法和反向酶谱法分别检测MMP-2和TIMP-2活性 对电泳条带进行灰度扫描，用酶解量表示酶的活性 条带的酶解量 = 条带面积×(条带灰度－背景灰度） 每个样品设两个平行样本，并经 3 次重复实验，每次实验均设同一参照 ? 用酶谱法检测MMPs 活性，结果表现为在蓝色凝胶背景上出现无色透明条带。本实验在凝胶上的透明条带分子量为62kD，根据分子量及底物（明胶）特异性，62kD为MMP-2的活化形式。随着肿瘤恶性程度的增加，MMP-2活性也明显增加，而TIMP-2的活性则与MMP-2相反，即随着肿瘤恶性程度的增加，TIMP-2活性明显降低 结 果 级 别 例 数 MMP-2活性 TIMP-2活性 Ⅰ 6 1.66±0.59 3.45±1.58 Ⅱ 8 2.15±0.68a 2.29±1.14a Ⅲ 6 3.21±1.21ab 1.18±0.35ab Ⅳ 5 4.11±1.65abc 0.68±0.12abc a: 与Ⅰ级比较, p＜0.05; b: 与Ⅱ级比较，p＜0.05; c: 与Ⅲ级比较, p0.05 表7 不同级别胶质瘤MMP-2和TIMP-2活性（x±s） C Ⅰ Ⅱ III Ⅳ 图17 不同级别胶质瘤MMP-2活性 C：正常脑组织；Ⅰ-Ⅳ：Ⅰ-Ⅳ级胶质瘤 c IV 胶质瘤细胞株体外侵袭能力的研究 实验四 将含有基质成分的Matrigel基底膜胶铺在多微孔的滤膜上，使在体外形成人工基底膜。在膜的下室加入趋化因子，加入到上室腔的肿瘤细胞，受到滤膜下面趋化因子的趋化作用而向下运动，当分泌的蛋白酶降解了覆盖膜孔的Matrigel后，才能运动到膜的下室面。计数膜下室面的细胞可定量反映肿瘤细胞的侵袭能力 本实验的基本原理是： 1.Boyden小室，由多伦多大学Kalinski教授惠赠 2.聚碳酸酯多孔滤膜（PVPF滤膜），孔径8μm 3.Matrigel基底膜胶, 主要为基底膜成分 4.抗MMP-2抗体，博士德公司产品 5.NIH 3T3细胞和U87MG恶性胶质瘤细胞株，由多伦多大学Kalinski教授惠赠 材料： 1.用NIH 3T3细胞制备含趋化因子的条件培养液，作为趋化因子的来源 2.在PVPF滤膜上室面铺Matrigel胶 3.在小室的下室腔加上述含趋化因子的培养液和DMEM培养液 4.将PVPF滤膜置于下室腔的培养液上，旋紧顶盖以固定滤膜 方法： 5. 在小室的上室腔内分别加入: 保温1h的U87MG恶性胶质瘤细胞（2×105） U87MG胶质瘤细胞+抗MMP-2抗体（对抗MMP-2） U87MG胶质瘤细胞+EDTA（抑制MMP-2活性） 每组设3个平行样本 6. 将侵袭小室置于CO2培养箱内孵育6h后终止孵育 7. 用棉签彻底擦去滤膜上室面的细胞，拧下顶盖，取出滤膜，甲醇固定，HE染色，封固 8. 将滤膜人为分为相等的9个区，每个滤膜在400倍光镜下计数除四角以外的5个区的肿瘤细胞数，计算平均值 分 组 孵育时间（h） 穿膜细胞数 抑制率(%) U87MG 6 231±72 U87MG+EDTA 6 48±17a 381.0 U87MG+MMP-2抗体 6 53±20a 335.8 a: 与U87MG组比较，p 0.01