果蝇幼虫唾液腺观察.docVIP

果蝇幼虫唾液腺染色体标本的制备与观察 【实验目的】 练习分离果蝇幼虫唾腺的技术，学习唾腺染色体的制片方法。? 观察了解果蝇唾腺学特征。? 【实验原理】 本世纪初，D Kostoff 用压片法首先在D Melanogaster 果蝇幼虫的唾液腺细胞核中发现了特别巨大的染色体——唾液腺染色体。事实上，双翅目昆虫（如摇蚊、果蝇等）的幼虫期都具有很大的唾腺细胞，其中的染色体就是巨大的唾液腺染色体。这些巨大的唾液腺染色体具有许多重要特征，为遗传学研究的许多方面，如染色体结构、化学组成、基因差别表达等提供了独特的研究材料。? 双翅目昆虫的整个消化道细胞发育到一定阶段之后就不再进行有丝分裂，而停止在分裂间期。但随着幼虫整体器官以及这些细胞本身体积的增大，细胞核中的染色体，尤其是唾液腺染色体仍不断地进行自我复制而不分开，经过许多次的复制形成约1000～4000拷贝的染色体丝，合起来达5mm宽， 400mm长，比普通中期相染色体大得多（约100～150倍），所以又称为多线染色体和巨大染色体。? 唾液腺染色体形成的最初，其同源染色体即处于紧密配对状态，这种状态称为“体细胞联会”。在以后不断的复制中仍不分开，由此成千上万条核蛋白纤维丝合在一起，紧密盘绕。所以配对的染色体只呈现单倍数。黑腹果蝇的染色体数为2n=2×4，其中第II、第III染色体为中部着丝粒染色体，第IV和第I（X染色体）染色体为端着丝粒染色体（图21-1）。而唾液腺染色体形成时，染色体着丝粒和近着丝粒的异染色质区聚于一起表成一染色中心，所以在光学显微镜下可见从染色体中心处伸出6条配对的染色体臂，其5条为长臂，1条为紧靠染色中心的很短的臂（图21-2）。? 由于唾腺细胞在果蝇幼虫时期一直处于细胞分裂的间期状态，所以每条核蛋白纤维丝都处于伸展状态，因而不同于一般有丝分裂中期高度螺旋化的染色体。唾腺染色体经染色后，呈现深浅不同，疏密各异的横纹。这些横纹的数目、位置、宽窄及排列顺序都具有种的特异性。研究认为这些横纹与染色体的基因是有一定关系，而一旦染色体上发生了缺失，重复，倒位，易位等，也可较容易地在唾腺染色体上观察识别出来。可见唾腺染色体技术是遗传学研究中一项基本的技术。? 【实验器材】 显微镜 双筒体式显微镜 解剖针（×2） 吸管 眼科镊 载玻片 盖玻片 滤纸条 果蝇三龄幼虫 苯酚品红 1mol/L HCl 蒸馏水 生理盐水（0.7%NaCl溶液，低渗液，目的是使细胞膨胀） 【实验步骤】 1三龄幼虫的饲养 要制备良好的唾腺染色体，首先需要发育良好的唾腺。所以需要使用发育良好的肥大的幼虫。这时饲养方法很讲究。一般遵循以下规则： 培养基富含营养 在意龄幼虫出现后，每天在培养基表片薄薄地滴上一层用新鲜的酵母或干酵母配成的2%~4%的水溶液，作为幼虫的补充食物，二、三龄幼虫期则滴加10%左右的酵母液。 虫口密度要小 在一新的培养瓶中接种10对左右亲蝇，24小时后即把它们清除，这样就不会因瓶中虫口密度太大而影响幼虫发育。 低温培养 在18~20℃的低温下培养。因低温有利于幼虫充分生长发育。但也有人认为低温培养并非必须，25℃下培养也同样可行。25℃下从接种到出现三龄幼虫的时间大约为5天，而20℃下则为7天左右。为了确保在实验室得到适龄的幼虫，可采取废弃接种的方法。 2剥取唾液腺 在一张载玻片上滴加生理盐水，从培养瓶中挑取一只肥大的幼虫，使其没于盐水中。之后取其唾腺雅片观察即可。（有人建议用雌虫制片，阴雌虫有两条X染色体，而雄虫仅有一条，所以雌虫的唾腺染色体中，由X染色质形成的臂较雄虫明显。区分雌雄幼虫的方法使用体式显微镜观察幼虫的后1/3处气管两侧的生殖腺，雄虫的精巢为透明的玻璃球状，比雌虫的卵巢大得多。） 将载玻片置于体式显微镜下。取两根解剖针，一根扎住幼虫口器，一根扎于体前1/3处，两针向两个方向迅速拉开。参照课本上的图找出唾腺。识别唾腺时抓住几个特征：①它是上小下大的囊状结构，唾腺旁边附着带状的脂肪。在解剖镜下（用侧或顶光源照明）可见唾腺是接近透明的结构，而脂肪常呈白色。②唾腺上的细胞较大，在解剖镜下依稀可见轮廓，放在显微镜的低倍镜上下调焦可清楚地看到。 用解剖针去除唾腺以外的组织，再小心剔除唾腺上的脂肪。对于初学者，一张片子上最好有3~4个唾腺，这样易于成功。剥离清楚的唾腺是肉眼可辨的一个很小的白点，看清这小点有利于下面的操作。 3解离和染色 用小滤纸条吸去生理盐水。在剥净的唾腺上滴一滴1mol/L HCl 解离2~3分钟，解离完毕用滤纸条吸取盐酸。在唾腺上滴加少许蒸馏水，浸泡1~2分钟后再用滤纸吸去蒸馏水，这步要重复三次，以洗净盐酸。再用滤纸吸去蒸馏水，滴加染液染色10分钟。染色时如染料干了，要及时补充。 在这个实验中，经常有同学在用滤