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核酶和反义寡聚核苷酸在临床上的应用 张雅琦 严芳 2004.11.05 核酶： 核酶(Ribozyme)是一种具有核酸内切酶活性的反义RNA分子，可特异性地切割靶RNA序列，具有解离后重复切割相同靶分子的能力。 核酶 核酶的发现 核酶的类型 核酶的应用 核酶的发现： 简史 发现过程 发现意义 Thomas R.Cech Sidney Altman  简史： 传统概念中酶都是蛋白质。因此，当1968年Francis Crick在他的论文“基因密码的起源”一文中提到“可能第一个酶是具有复制能力的RNA”时，没有人予以注意。 20年后，在1987年第52届冷泉港定量生物学国际讨论会上Alan Weiner做会议总结时又重复了20年前Francis Crick的话，会议注意力已集中到最近发现的具有酶活性的RNA分子上。 1989年诺贝尔化学奖授予了分别独立地发现具有酶活性的RNA分子的美国科罗拉多大学（ColoradoUniversity）的Thomas R.Cech和耶鲁大学（YaleUniversity）的Sidney Altman。 核酶的发现： T.Cech的工作 T.Cech的重要发现开始于1982年 研究目的：细胞中DNA转录成rRNA后，rRNA中一些无意义的序列，或“内含子”（intron），如何从RNA分子中剪切下来的。根据过去传统的概念，这一过程必须要有蛋白质酶来完成。 T.Cech的工作 研究对象：原生动物四膜虫（Tetrahymena Thermophila）：含有一种RNA，其组成中除了核糖体RNA外还有一个由413个核苷酸组成的插入序列（interveningsequenc，IVS）。 研究发现：转录产物rRNA前体很不稳定，在鸟苷和Mg2+存在下切除自身的413个核苷酸的内含子（IVS），使两个外显子拼接起来，变成成熟的rRNA分子。催化反应是在没有任何蛋白质酶的存在下发生的，称为自我剪接。 Cech的实验结论： ?IVS具有类似蛋白酶的功能，能够打断及重建磷酸二脂键。 ?相信rRNA前体能靠自己完成剪接过程。在一定条件下rRNA前体可以按一定方式盘绕，进而自己切割自己，以后再把保留rRNA部分的末端连接起来。即它是可以催化自由底物的具有酶活性的RNA。 ? RNA分子具有自身断裂的催化作用，以及酶活性的另一个重要方面即催化其他分子的反应。 S.Altman的研究工作： 研究目的：t-RNA分子的剪接过程 研究发现：在较高浓度的镁离子和适量精氨酸参与下，核酸酶P（ribonuclease P， RNase P ）中的 RNA能够切割tRNA前体的5’端。 S.Altman的实验结论： ?过去都认为核酸酶P的催化作用由RNA和蛋白质共同完成的。 ?而该实验证明，核酸酶P的催化作用是由RNA完成的，而其中的蛋白质在细胞内仅仅起稳定构象的作用。 核酶发现的意义： 1.它突破了“酶是蛋白质”的传统概念。 自从60多年前J.Summer首先结晶了脲素酶（Urease），并证明这个结晶蛋白能催化脲素水解以来，很多酶被纯化，而且都是蛋白质。从而酶被定义为“生物催化剂是一种称作酶的特殊蛋白”，“使代谢进程加速的生物催化剂”。核酸性酶的发现无疑是对传统的酶和催化理论巨大的冲击。 ??? ??? 核酶发现的意义： 2.核酸性酶的发现对科学家们普遍感兴趣的生命的起源这一问题有了新的认识，对生物前化学（prebiotic chemistry）有重要贡献。 长期以来对生命起源中是先有蛋白质还是先有核酸争论不休。核酸分子含有合成蛋白质的氨基酸序列的信息，而蛋白质（酶）又是在核酸修复、转录、剪接、翻译等等所有环节中必须存在的。因此谁先谁后的问题就像“鸡与鸡蛋”的问题一样令人困惑。 核酶的类型： 剪切型核酶： 这类核酶催化自身或者异体RNA的切割，相当于核酸内切酶。 剪接型核酶： 这类核酶具有核酸内切酶和连接酶两种活性。 核酶的酶活性种类: 核苷酸转移作用 磷酸二酯键水解作用 磷酸转移反应催化作用 脱磷酸作用 限制性内切酶作用 剪切型核酶： 锤头型核酶 发夹型核酶 丁型肝炎病毒（HDV）核酶 蛋白质—RNA复合酶（RNaseP) 剪接型核酶： 组?内含子 组? ?内含子 内含子和外显子： 内含子：基因内的间隔序列，它不出现在成熟的RNA分子中，也就是说在转录后要通过加工被切除。 外显子：最后出现在成熟RNA中的序列。 锤头型核酶： 锤头核酶是从类病毒中分离出来的。它本来是一个顺式切割的酶，将其分为酶链和底物链两部分后就转变为靶标特异性的反式切割的酶，在防止有害基因的表达上具有很大的应用价值。 锤头型核酶： 形状：一类较小的核酶，长约30