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免疫细胞功能的测定 上海交通大学医学院 胡翊群 教授 T细胞增殖功能测定 基础理论 本技术用于评估T细胞对各种刺激的增殖能力。T细胞增殖能力是反映T细胞功能的一个重要指标。 免疫细胞功能的测定 T细胞功能的测定 刺激T细胞增殖的因素及意义 1. 特异性抗原： 引起寡克隆活化增殖。 克用于判断抗原免疫的效果（疫苗接种）和回忆反应能力，也能反映T细胞总体的功能。 2. 丝裂原：多克隆。 3. 刺激信号转导分子：多克隆。 T细胞增殖功能测定 T细胞增殖测定方法 1. 显微镜下观察细胞形态与细胞计数。 2. 放射性核素掺入试验。 细胞增殖时，DNA复制，须从培养液中补充核苷酸。用放射性核素标记培养液中提供的胸腺嘧啶（3HTdR），当DNA复制时， 3HTdR掺入正在分裂的细胞的DNA中。细胞增殖程度与细胞内掺入的3HTdR的量成正比。通过用液闪仪定量测定培养细胞中的放射性强度，就可以确定T细胞增殖的能力与强度。 丝裂原诱导的增殖反应 诱导T细胞增殖反应的丝裂原 1. PHA（植物血凝素） 2. Con A（刀豆蛋白 A） 3. PMN（美洲商陆） T细胞增殖功能测定 丝裂原诱导的增殖反应 技术方法 1. 用RPMI－10将PBMC配成1x106/ml的悬液。 2. 用100g/ml的PHA配制1:10、1:20和1:40稀释液。 3. 96孔板中选择一行（共12孔），每孔中加入100µl细胞。指定每相邻3孔为一组。前3组分别加入一种稀释度的PHA溶液，最后一组加培养液（对照组）。 4. 37°C ，5％CO2，54h。 5. 配制浓度为50µci/ml的3HTdR。 T细胞增殖功能测定 丝裂原诱导的增殖反应 6. 每孔加入50µci 3HTdR，继续培养18h。 7. 用多孔自动收集仪分别收集每孔细胞于一小管中。溶解细胞，将DNA过滤到滤纸上，洗去未掺入的3HTdR，最后用100％的甲醇洗涤，以利滤纸干燥。 8. 将滤纸放入液闪管内，自动计数，打印结果。 9. 扣除本底，计算每一组3个复本的平均数。 T细胞增殖功能测定 丝裂原诱导的增殖反应 影响因素 1. 细胞活力：冷冻技术影响细胞活力，复苏后应检查细胞活力。 2. 培养液中添加的血清：有些血清可能激活或抑制细胞增殖。如欲测定人体细胞增殖能力，可采用灭活的AB血清。 3. 细胞培养板类型：根据细胞数量采用不同形状底部的培养板。 4. 微生物污染：可降低细胞增殖能力。 T细胞增殖功能测定 单向混合淋巴细胞培养反应 原理 T细胞受体能够识别同种异型MHC分子。当把2个不同个体的单个核细胞在体外混合时，可以相互刺激，引起增殖。增殖的强度与两者之间MHC的差别的程度成正比。所以同种异型混合淋巴细胞反应的强度反映2个个体之间MHC差别的程度，并且因为相互识别与增殖，结果是2个个体的淋巴细胞增殖能力的总和。这种试验就是双向混合淋巴细胞培养试验。 将参加反应之一方的单个核细胞用放射性核素照射，使其失去反应能力，但仍保存刺激能力，成为刺激细胞，则此时的反应结果仅反映另一方（反应方）的增殖能力。在实质性器官移植时，只需了解受者淋巴细胞对供者MHC的反应能力，所以适合采用单向混合淋巴细胞培养反应。 T细胞增殖功能测定 单向混合淋巴细胞培养试验 方法 1. 分离宿主与供者的PBMC，调整细胞浓度为1 x 106/ml。 2. 刺激细胞灭活：用丝裂霉素（终浓度25µg，37 °C， 5％C，30min）或放射性核素照射（2000 rad）的方法处理刺激细胞。 3. 96孔板中，每孔加入1x105的刺激细胞和1x105反应细胞。 37°C，5％CO2，4～6d。加3HTdR，继续培养18h。阳性对照孔加反应细胞和丝裂原，不加刺激细胞。阴性对照孔只加照射的自身细胞。3复本。 4. 收集细胞，液闪仪计数，打印结果。 T细胞增殖功能测定 单向混合淋巴细胞培养 5. 计算相对反应（RR） （实验组cpm－阴性对照组cpm） RR＝ 阳性对照组cpm－阴性对照组cpm T细胞增殖功能测定 单向混合淋巴细胞培养 注意点 1. 细胞活力：使用冷冻细胞时，复苏后应检查细胞活力。 2. 培养液中添加的血清：有的血清可能会刺激或抑制反应。 3. 本底应小于2000 rpm，阳性对照组应大于20000 rpm。 T细胞增殖功能测定 抗原诱导的特异性增殖反应 原理 本试验测定T细胞在体外对某一特定抗原的特异性免疫应答能力。所用抗原可以是初次接触的抗原，也可以是曾经免疫过