植物基因组dna和rna的提取整理版课件.ppt

3. 核酸制备的一般步骤： 3. 注意事项——材料准备 3. 注意事项——细胞裂解 3. 注意事项——核酸分离、纯化 3. 注意事项——核酸沉淀、溶解 4. DNA提取常见问题 5. DNA提取常见问题 5. DNA提取常见问题 Plasmid DNA Extraction (Midiprep).flv mRNA Extraction from Total RNA.flv 操作步骤 提取RNA 过程中防止RNA酶的污染所采取的步骤 处理RNA样品时必需仔细小心，其程度取决于样品的用途和来源 由于RNA酶存在于所有的生物中并且能够抵抗诸如煮沸这样的物理破坏，固此建立一个无RNA酶的环境对于制备优质RNA很重要 对于制备mRNA来说这些预防措施尤其重要。 提取RNA 过程中防止RNA酶的污染所采取的步骤 方案： 1) 工作区域应与进行普通微生物实验的区域分离好，特别是那些用于细菌接种、培养基和试剂配制的区域，那些培养基和试剂用于从细菌和动物细胞中进行DNA的制备和操作。通常认为这些区域富含RNA酶。 2) 如有可能，使用标有“无RNA酶”的商品试管、吸头、溶液和水。通常新的无菌处理过的塑料试管和吸管无RNA酶 提取RNA 过程中防止RNA酶的污染所采取的步骤 3) 双蒸水(ddH2O)和溶液应该用RNA酶的抑制剂DEPC(焦碳酸二乙酯)进行处理：每100mL溶液或水中加入0.1mL DEPC原液，放在摇床上充分混匀并在37℃下作用数小时。然后将溶液高压灭菌15min使DEPC失活。 4) 用分子级的试剂和DEPC处理过的水配制的溶液通常没有RNA酶。 5) 分离RNA以前，将一些实验室玻璃制品置于烤箱在300 ℃ 烘烤4h以灭活核酶。如有可能，将其他设备也灭菌处理。 提取RNA 过程中防止RNA酶的污染所采取的步骤 从组织中提取RNA则要注意： 动物器官的解剖器械 存放组织块的玻璃器皿 冻存组织块所用的器皿 组织器官的冲洗液 人汗含有RNA酶，故在所有步骤中均应戴手套并经常更换。 周围环境含有大量的微生物和气雾，它们来自吸液操作或来自我们自己的呼吸。可能造成RNA酶的污染 一些组织像脾脏可能比其它组织含有更多的RNA酶。细菌比哺乳动物细胞中有更多的RNA酶。因此从这些细胞中制备RNA应采取更严格的预防措施。 分离后的RNA通过琼脂糖凝胶电泳再经溴化乙锭染色后便可检查其是否完整。rRNA(18s和28s) 条带模糊可能表明由RNA酶引起的RNA的降解。 4.?配制的溶液应尽可能的用0.1% DEPC，在37℃处理12hr以上。然后用高压灭菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经0.22μm滤膜过滤除菌； 5.?操作人员戴一次性口罩、手套，实验过程中手套要勤换； 6.?设置RNA操作专用实验室，所有器械等应为专用。 思考： 如何从总RNA中分离mRNA? mRNA Extraction from Total RNA.flv 1．材料： 组织或者细胞 2. 方法： TRIzol法，试剂盒 二. 动物基因组总RNA的提取 就己沥酝檀损恕窥蛀吗吭悸洋套集申铸酞蚤吊廷刑层楞雏魂民检耳勒祭对动物基因组DNA和RNA的提取动物基因组DNA和RNA的提取 总RNA提取试剂盒 亚硫氢胍，巯基乙醇，n-月桂肌氨酸：变性细胞内及核蛋 白复合物，释放RNA；有效抑制核酸酶。 苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）（pH4.7）：酸平衡苯仿可抽提去除杂物。DNA及蛋白沉淀到有机相，RNA留在水相。酸性有机溶剂的抽提可免除用氯化锂选择沉淀RNA。用锂沉淀导致小于5.8sRNA的丢失，并不利于下游操作。 乙酸钠（pH4.0）：维持变性的细胞裂解液的pH值，及沉淀RNA。 砌逾患背兄疵惋划隆寐荫极树怔截破夜盈秀离冤主旺怖驶尘央算乳泵京讯动物基因组DNA和RNA的提取动物基因组DNA和RNA的提取 1．TRIzol试剂 2．氯仿 3．异丙醇 4．75%乙醇（DEPC水配制） 5．DEPC水 TRIzol法提取RNA 试剂准备: 菜池膀办商煌详章应钦踩多澈素址建字品布截动阔店烛穷折吾妮磺逆度哑动物基因组DNA和RNA的提取动物基因组DNA和RNA的提取 TRIzol法（组织） 戴一次性手套将组织样品从液氮中取出，用干灭过的剪刀将样 品外包裹用纱布及表层的肉样剪掉，然后放入干灭过的研钵中，往研钵中倒入液氮，快速研磨成细末状； 用1ml一次性塑料吸头挑取细末装入灭过菌的7mL一次性塑料离心管中用电子天平进行称量，每管中称取0.2g样品； 往管中加入2 mL TRIZOL，用力振荡后于15-30?C温育5