课件第八章 常用分子生物学技术.pptVIP

第八章 常用分子生物学技术  第一节 核酸分子杂交技术 第二节 DNA序列测定 第三节 聚合酶链反应（PCR) 第四节 生物芯片技术 第五节 基因克隆技术 第六节 基因转移技术 第七节 基因敲除技术 第一节 核酸分子杂交技术 核酸分子杂交 核酸分子杂交的分类 液相杂交： 待测核酸样本与特异性探针同时溶于杂交液中进行杂交反应； 固相杂交： 待测核酸样本先结合到固相支持物上，再与溶液中的特异性探针进行杂交反应。 常用固相杂交支持物： 硝酸纤维素膜、尼龙膜等－－－ 核酸分子杂交（固相杂交）操作程序 常用固相核酸杂交方法 Southern 印迹杂交法（Southern blotting ） Northern 印迹杂交法（Northern blotting ） 斑点杂交或狭缝杂交法 （Spot/ Slot blot hybridization） 菌落杂交（colony hybridization） 夹心杂交法（sanwich hybridization） 原位杂交（nucleic acid hybridization in situ） 蛋白质的印迹分析 (Western blotting) （2）Northern 印迹杂交法 （Northern blotting ） （其基本过程类似于上述Southern法） 提取RNA样本→RNA变性→琼脂糖凝胶电泳分离→转移至膜→探针（标记DNA或RNA）与之杂交→显影或显色→检测信号。 Northern法可用于检测组织细胞中总RNA或mRNA （3）斑点杂交或狭缝杂交法： 基本过程： 将变性的DNA或RNA直接点到固相支持滤膜上→用标记探针与之杂交→自显影或显色反应→检测杂交信号→分析结果。 优点： 简便、快速、灵敏、样本用量少； 缺点： 特异性不高，有一定比例的假阳性。 原位杂交（nucleic acid hybridization in situ） 将标记探针与细胞或组织切片中的核酸进行杂交，进而检测特异的DNA或RNA序列。 细胞原位杂交 组织切片原位杂交 DNA-DNA RNA-DNA 三类杂交 RNA-RNA 该法优点： 不需提取核酸，故可完整保持组织或细胞的形态，因而更能准确地反映组织细胞的功能状态。 第二节 DNA序列测定 （Sanger双脱氧核苷酸末端终止法） 原料：单链模板DNA 引物 * DNA聚合酶Ⅰ 底物* ：dATP、 dGTP、 dCTP、dTTP ddNTP 第三节 聚合酶链反应（PCR技术）Polymerase chain reaction PCR定义/原理： 引物 反应体系 高温变性、低温退火和适温延伸三个阶段的循环周期使模板以几何级扩增 PCR特点 快速、特异、灵敏、简便。可用于极微量， 甚至单个DNA模板的体外分子克隆 模板DNA 特异性引物 耐热DNA聚合酶（Taq酶） 底物dNTPs Mg2+ PCR体系各要素及其作用 （1） 模板 PCR模板可以是DNA或RNA。 以线性DNA模板为佳，量适中，一般为102?105个拷贝； RNA作为模板时，需要： RNA cDNA PCR, 称此为RT-PCR. （2）耐热DNA聚合酶(Taq DNA聚合酶) 是从耐热细菌体内提取的一种DNA聚合酶，可在95℃稳定30分钟。从而保证PCR在[94℃变性→ 55℃退火→71℃延伸]循环30次过程中不变性失活。 在PCR中，Taq DNA聚合酶应用最广泛。 （3）引物 引物是根据已知序列的模板DNA待扩增区两端而设计的一对寡核苷酸小片断，长度一般为15?30个碱基。 引物是保证PCR扩增产物的大小和特异性的关键因素，其设计与合成对PCR的成功至关重要。 引物设计原则如下： 设计引物的原则： 二条引物分别位于被扩增片段的两端，与模板正负链序列互补 长度为18 ~ 25个