（PPT）乙型肝炎病毒cccDNA检测方法与应用价值课件.pptVIP

乙型肝炎病毒cccDNA ——检测方法与应用价值;一、几个相关问题简介;什么是HBV cccDNA?;乙型肝炎病毒基因组结构示意图;乙型肝炎病毒的复制过程;我们为什么要关注HBV cccDNA?;为什么没有cccDNA检测试剂盒问世?;;;二、HBV cccDNA检测技术;;;设计一对特殊引物：跨双缺口引物　 正义引物P1 ：与负链互补结合，位于正 链缺口上游 反义引物P2 ：与正链互补结合，位于负 链缺口下游 目的：rcDNA不被扩增;选择性PCR：rcDNA不被扩增;选择性PCR：cccDNA能被扩增;PCR产物自身退火（self annealing）; 国内外许多研究者忽略了这个问题，rcDNA被大量扩增，阳性结果不可靠，定量结果也不可靠 Hepatology Research 2003;15: 234-243（PBMC） World J Gastroenterol 2004;10(1):82-85(血清); 与定性法比较增加了一个荧光探针，探针位于扩增片段区（负链缺口下游），与cccDNA的负链互补。;rcDNA不能被扩增 无荧光信号;实时荧光定量PCR的原理;实时荧光定量PCR的原理;实时荧光定量PCR的原理; 标准曲线方程YCt= 42.0827-3.5554logXcopy 相关指数： R2=0.995 灵敏度至少可以达到103copy/ml ;·同样存在PCR产物自身退火引起的rcDNA 非特异性扩增的问题 ·由于灵敏度较普通PCR高，假阳性率比普 通PCR更高;质粒标准品107copy/ml;解决方案;;2.侵入者探针法(Invader assay);;;侵入者探针法定量检测cccDNA的优缺点;;3. 嵌合引物荧光PCR法;P; 嵌合引物荧光PCR的优缺点; 无论是选择性荧光PCR，还是侵入者探针法或嵌合引物荧光PCR，本身都不能解决在高rcDNA背景条件下的假阳性问题，必须结合抽提分离、酶切纯化等步骤，以提高特异性。;三、影响cccDNA池的因素;1.cccDNA池的自身恒定;2.抗病毒药物对cccDNA的影响;抗病毒药物;阿德福韦治疗48周结果;3.肝外组织也是cccDNA的储存池？;(1)有关PBMCs中cccDNA检测的研究;PBMCs中cccDNA检测结果不一的原因;(2)关于血清中是否存在cccDNA的问题;(2)关于血清中是否存在cccDNA的问题;四、今后需要研究的问题;?加强HBV慢性感染者不同病情和病期肝组织和肝外 组织中cccDNA水平研究 ?研究HBV cccDNA在血液中的降解时间对血清检测 的意义 ?以肝移植患者为研究对象，探究肝外组织cccDNA ??，并据此研究HBV慢性感染者肝外损害的机制等 ?能否通过血清中可能存在的cccDNA及其含量的动 态观察，对HBV感染肝衰竭患者进行预后分析？ ?能否把cccDNA检测作为研制新的抗病毒药物疗效 的评价标准？ ?生物疗法（包括基因疗法）是否应该“聚焦”核内 cccDNA？;Thank you;%peofLSMT7Frzqv1EHcbHxUcWawHvb0NUxaqErsnp$5PfQQ+hwjveF-znR-Y3z48PrRS7sRMhMJS7jsxplZQgQcvbkm4KhS!HcpNby#HEHo4pxaWpkRZFcLz*11BnvV*ZzjoI%lEC4W7YidNy0eBd*63%$w5+qA2KzNOA-KcPiy24194UguyVAX!ICjC*ggetP3q44IOoVzot9S$VXhYpTY1EWIbF1*81MMv!1ALNTAAfcSQuQWDU(7wCn5ihxXixS55HyrFsnu4r!pI*6BO)0A5(jP)0FQ8D4GI1zrOw198Wds3Ei%hyX0FrYxaLSFCrwl-MvIH2UM*vBI(EKjfD0t#K1RpqxG7rFDb(SxvR4n2eZnNvnfotBCnJ%BFj(lzV2Tv7fqbJMuu)U)ijVyzz!3vgQ3j68en#E-ED5E1u$VgPC(y5ykPWH5QaEN(OdS$UjLgjhdT-Ji9RwdLhCz-D0WX0CefnSxOBCY%KC9#J2ROyNg4SfXuGXQov2r6KpjzuKkzAn0mkq1NOlWvQ$W5An$jPo5krIeJW1FGzbGM1%tkiB8is$5K*QNjy4$pekYVe(u(BWCnSPIIiJ+gN371!5WeR8y4f!)rf0ILB)pm+