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一起蜡样芽孢杆菌引起食物中毒病原学检测 　　[摘要] 目的： 查找本次食物中毒的特点及引发食物中毒的致病菌。方法：流行病学调查食物中毒特点，对8份剩余食物留样，并采集患者的1份呕吐物及数份肛拭和环节样品， 采用传统细菌培养和分子生物学技术相结合的方法进行病原学筛选检测及目标菌鉴定。结果： 在剩余8份留样菜中7份检出蜡样芽孢杆菌，一份呕吐物和一份环节样品也检出蜡样芽孢杆菌。结论： 这起食物中毒是由于食用了被蜡样芽孢杆菌污染的食物而引起，并以呕吐型为主。 　　[ 关键词] 食物中毒；蜡样芽孢杆菌；Real_time PCR 　　[ 中图分类号] R155?? 　　蜡样芽孢杆菌（ Bacillus cereus，Bc） 是常见的食品污染菌， 广泛存在于土壤、水、空气以及动物肠道等处，其能导致两种类型的食物中毒：腹泻型和呕吐型，在我国以呕吐型多见[1]。虽然由蜡样芽孢杆菌引起的食物中毒通常症状较温和而且可自愈，但国内外也有报道有蜡样芽孢杆菌引起食物中毒而致死的案例，目前，国内外文献报道由于蜡样芽孢杆菌发生食物中毒导致死亡的案例有14起 [2，3]。因此我们应该重视蜡样芽孢杆菌引起的食物中毒，提高其检测效率，并加强预防措施。 　　本文就关于2011年9月8日上海市松江区一所幼儿园27名幼儿发生食物中毒事件进行流行病学调查和致病菌病原学检测。 　　1.材料与方法 　　1.1流行病学调查 　　2011年9月7日晚上，幼儿园老师陆续接到家长电话称孩子有腹痛、呕吐情况，园长了解情况后逐一给孩子家长打电话，确定有27个小朋友感到不适送医，其主要症状均为恶心呕吐，伴随腹痛，怀疑发生食物中毒，流行病调查结果显示患儿最早发病在当天下午16：30，最晚发病的在晚上20：30，最短的潜伏期为5小时，最长的潜伏期为9小时。随后27名小朋友在医院经过抗生素治疗均已经出院。 　　当天的菜谱为：午餐是四鲜水饺、烧卖、紫菜蛋皮汤、西瓜，午点是虾皮粥，采集当天剩余食物，且同时采集9月5、6日的残留菜油麦菜胡萝卜、百叶包、番茄蛋汤、蒜末生菜和栗子烧鸡腿做病原生物学检测。 　　1.2实验室检查 　　1.2.1材料 　　1.2.1.1 标本由上海市松江区食品药品监督局采集幼儿园餐??8份留样菜、1份患儿呕吐物和数份环节样品和肛拭子，及时送松江区CDC实验室检测。 　　1.2.1.2 蜡样芽孢杆菌Real_time PCR核酸检测试剂盒（批号购自上海之江生物技术有限公司 　　1.2.1.3 MYP培养基、50%卵黄、新生霉素及肉汤均购自上海市CDC 　　1.2.2 仪器 　　1.2.2.1 ABI 7500扩增仪购自life tech公司 　　1.2.2.2显微镜BX51TR购自Olympus公司 　　1.2.2.3 API 50 CH 生化板条（批号：1000169240）、生理盐水、细菌比浊仪M005230及全自动细菌鉴定仪ATB-1525均购自法国生物梅里埃 　　1.2.3方法 　　1.2.3.1 蜡样芽孢杆菌分离、鉴定、计数按照中华人民共和国卫生部发布的《食品安全国家标准食品微生物学检验》（GB/T4789.14-2003）相关要求进行，细菌的生化鉴定使用法国生物梅里埃的API 50 CH生化板条。 　　1.2.3.2 蜡样芽孢杆菌毒素基因检测采用Real_Time实时荧光PCR扩增法，DNA的提取及基因检测按照试剂说明书进行。 　　2.结果 　　2.1分离培养鉴定 将剩余的八份留样菜分别以10-1、10-2、10-3、10-4、10-5五个浓度梯度接种于MYP平板，肛拭、呕吐物和环节样品直接接种于MYP平板，经36℃培养24小时后观察结果。结果显示一份呕吐物，一份冰箱内壁及食品中七份样品均有可疑菌落，肛拭子和其他环节样品未发现可疑菌落。蜡样芽孢杆菌在MYP平板上菌落较大，呈淡粉色，边缘不整齐，菌落周围有粉红色的晕，镜检为革兰阳性粗大芽孢杆菌，MYP平板培养结果如图一所示。 　　2.2蜡样芽孢杆菌计数 在10-1、10-2、10-3、10-4、10-5五个浓度梯中分别选择可以清楚计数的浓度梯度的平板挑取5个可疑菌落做生化鉴定，结果证实为蜡样芽孢杆菌，根据GB/T4789.14-2003中公式计算，八份留样菜中蜡样芽孢杆菌计数结果如表一所示。 　　2.3毒素基因检测 在八份留样菜中，Real_Time PCR法有七份检出蜡样芽孢杆菌毒素，包括油麦菜胡萝卜、百叶包、番茄蛋汤 、蒜末生菜 、 栗子烧鸡腿、 海带虾皮汤、四鲜水饺和烧卖；另外一份呕吐物、一份冰箱内壁的环节样也检出蜡样芽孢杆菌毒素，实验分别设阴阳性对照，结果如图二所示。 　　3.讨论 　　在本次食物中毒事件中，肛拭子中未检出致病菌，而在7