p73基因在成人急性淋巴细胞白血病中表达研究.docVIP

p73基因在成人急性淋巴细胞白血病中表达研究 　　【摘要】 目的：研究p73基因在急性淋巴细胞性白血病（ALL）发病机制中的作用及临床意义。方法：收集32例ALL患者及30例正常对照组骨髓样本，DNA和RNA抽提后用RT-PCR检测p73基因的表达、甲基化特异性PCR（MSP）检测p73基因第一外显子甲基化状态，并结合临床资料进行分析。结果：11例p73基因阴性表达，阴性表达率为34.38%，其中9例第一外显子区域均发生甲基化（81.82%）；21例p73基因阳性表达，32例ALL患者中，仅1例发生甲基化（4.76%）；正常对照组30例，均为p73基因阳性表达，阳性表达率为100%。p73基因的阴性表达与ALL患者的高年龄（≥60岁）、高白细胞数（≥30×109/L）及对治疗时间延长（4周取得完全缓解）有关。结论：p73基因异常表达与成人ALL的发病机制有关，具有一定的诊断及判断预后的价值；其甲基化可能是p73基因在ALL中表达沉默的主要机制。 　　【关键词】 p73 基因； 急性淋巴细胞白血病 　　急性淋巴细胞白血病（acute lymphocytic leukemia，ALL）是造血系统恶性疾病之一，其病死率高[1]。因此，期望通过精准有效的分子生物学方法检测相关基因的改变，以探究白血病发病机制和治疗方法成为热门课题。p73基因是p53基因家族的一个新成员，具备抑癌基因的特性[2]。本文通过试验研究ALL中p73基因mRNA表达情况及其甲基化状态，以及其和临床关系，探讨p73基因在ALL发病机制中的作用及其异常表达的临床意义。 　　1 资料与方法 　　1.1 一般资料 （1）ALL组患者：2012年1月-2013年3月在本院收治的初发ALL患者32例，男17例，女15例，年龄18～74岁。参照2008年WHO诊断标准，所有患者均经临床、骨髓细胞形态及染色体学、病理学、白血病免疫分型确诊。（2）对照组：收集同期非白血病患者30例，骨髓学均正常，为对照组。两组年龄性别等一般资料比较差异均无统计学意义（P0.05），具有可比性。 　　1.2 方法 　　1.2.1 标本采集 化疗前，无菌条件下抽取ALL组及对照组患者骨髓各4 mL，Trizol（美国Gibco公司）一步法提取总RNA。骨髓标本采用离心柱法及时提取DNA。所有引物由上海生物工程公司合成。 　　1.2.2 p73基因表达分析 RT-PCR检测p73基因mRNA的表达。提取的总RNA用RT-PCR试剂盒（美国Gibco公司）按说明书合成cDNA。p73引物序列：上游5’-AGCGGAATT CACCACCATCCT-3’，下游5’-CCAGGCTCTTTCAGCTTCA-3’，产物390 bp。取1μLcDNA，以β-actin为内参，RT-PCR扩增p73基因片段，产物长度为166 bp。PCR反应条件为94 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 45 s，30个循环。PCR产物用凝胶电泳分离。 　　1.2.3 甲基化特异性聚合酶链反应（MS-PCR） 取2 μg基因组DNA，采用DNA甲基化试剂盒进行重亚硫酸盐修饰并纯化。根据p73基因第一外显子CpG岛序列特征设计甲基化特异性引物p73-MF、p73-MR和非甲基化特异性引物p73-UF、p73-UR。引物序列p73-MF：5’-GGACGTAGCGAAATCGGGGTTC-3’；p73-MR：5’-ACCCCGAACATCGACGTCCG-3’；p73-UF：5’-AGGGGATGTAGTGAAATTGGGGTTT-3’；p73-UR：5’-ATCACAACCCCAAACATCAACATCCA-3’，行甲基化特异性PCR（MSP），PCR产物用凝胶电泳分离，MSP产物大小分别是68 bp 和77 bp。 　　1.3 统计学处理 采用SPSS 13.0 软件行统计学分析，计数资料采用 字2检验，等级/频数资料用Z检验，以P4周CR者的75.00%、70.00%、66.67%，比较差异均有统计学意义（P0.05）。见表3。 　　3 讨论 　　p73基因是p53基因家族中发现的一个新成员，是一个新的抑癌基因，由13个外显子和12个内含子组成[3]。其检测的基因序列与p53具有高度的同源性，也具有调控细胞正常生长，诱导细胞周期阻滞和凋亡，参与DNA损伤的修复作用[4]。肿瘤发生发展的本质在于细胞的生长与凋亡之间的动态平衡状态被打破，从而导致细胞过度生长，凋亡抑制受阻，作为抑癌基因的p73基因在肿瘤的发病中占有重要的地位，具有可抑制肿瘤细胞生长、诱导肿瘤细胞发生凋亡的特性。国外大量临床研究发现，p73基因在人类肿瘤中极少发生突变，在多种人类肿瘤中有不同水平表达的现象[5]。该基因与多种肿瘤的