用链霉菌生产维生素B的工艺设计.docVIP

前言 一、维生素B12的结构与功能 维生素B12又称(cyanocobalamin)，是一种含有钴的咕啉类有机化合物，为深红色结晶或结晶粉末，分子式为C63H88CO14N14P，分子量：1355.38维生素B12是人体组织代谢过程中必需的维生素，是人和其它哺乳动物维持生长和促进红细胞生长的重要因子，具有广泛的生理作用，参与体内甲基转换及叶酸代谢，促进神经髓鞘中脂蛋白的形成，保持中枢神经和外周髓鞘神经纤维的功能完整。临床上用于治疗恶性贫血和恢复造血功能，也用于神经系统疾病如多发性神经炎、末梢神经麻痹等。维生素B12B12的生产菌种 维生素虽然广泛的存在与自然界，但是自然界维生素B12唯一来源出于微生物菌种[2]的生物合成。见表1-1。 维生素B12生产的菌种 培养基主要成分 发酵条件 Vbl2产量/mgL-1 Propionibacterium freudenreichii 葡萄糖 厌氧,添加DMB 206.0 Rhodopseudomonas protamicus 葡萄糖 添加DMB 135.0 Propionibacterium shermanii 葡萄糖 添加DMB 60.0 Pseudomonas denitrificans 蔗 糖 好氧，添加甜菜碱 60.0 Nocardia rugosa 葡萄糖 好氧 18.0 Rhizobium cobalaminogenum 蔗 糖 好氧 16.5 Micromonospora sp. 葡萄糖 添加DMB 11.5 Streptomy cesolivaceus 葡萄糖 添加DMB 6.0 Nocardia gardneri 十六烷 好氧 4.5 Butyribacterium ethylotrophicum 甲醇 好氧 3.6 Pseudomonas sp. 甲醇 添加DMB 3.2 Arthrobacter hynlinus 异丙醇 添加DMB 1.1 表1-1 具有维生素B12生产能力的菌种及其生产过程 三、维生素B12的生物合成路径 维生素B12的生物合成十分复杂，涉及的步骤达七十多步，涉及相关合成基因30余个。研究方法涉及分子克隆、酶学、化学合成、同位素标记和核磁共振等。Battersby和Scott实验室的工作者通过对脱氮假单胞菌(Pseudomonas denitrificans)的研究，阐明了维生素B12好氧合成路径。最终历时25年才绘制出维生素B12的合成路线图。如图1-2所示。 四、维生素B12生产工艺改进的措施维生素B12用新技术、新工艺改造传统产业，可以采用诱变育种方法，以此提高出发菌株的发酵单位在发酵过程中补加前体如谷氨酸等，也可补加钴盐及甜碱，主要促进细胞表面对代谢产物的分泌。在发酵工艺上可采用厌氧、好氧周期交替，循环操作工艺，也可在发酵液中补加分解丙酸的微生物，以提高维生素B12产率。 ????(2)积极开发维生素B12衍生产品及下游产品：努力开发氰钴维生素B12、氯钴胺维生素B12、甲基维生素B12、腺苷维生素B12、羟基维生素B12等系列产品。 2 菌种的选育 2.1 链霉菌菌种的选择性分离 链霉菌发酵生产发酵维生素B12的整体过程，选择性分离[3]的步骤一般是：含微生物材料采集 →→ 标本材料的预处理 →→ 菌种的分离 →→ 菌种富集培养 →→ 菌种初选 →→ 菌种复选 →→ 菌种纯化 →→ 菌种保藏。 2.1.1 含微生物材料的选择和预处理 链霉菌尤其出现在含有机质丰富的微碱性土壤中。我们应该对选择的微生物材料进行预处理。由于链霉菌的孢子比革兰氏阴性耐热，可采用物理的加热灭菌[3]法，让采集的样品在100℃加热1h或40℃加热2—6h基本达到了减少细菌的目的，或采用养料中加入1％(质量分数)的几丁质培养，也可以达到目的。 2.1.2 菌种的分离 菌种的分离效率取决于分离培养基的养分、pH值和加入的选择性抑制剂，选择性分离链霉菌比较好的是采用胶态几丁质和矿物盐的培养基，pH值在6.0-7.5 之间，可加入一些抗生素（制霉菌素或亚胺环己酮）来抑制其他菌种的繁殖和生存。 2.1.3 菌种的培养 对于链霉菌可以用马铃薯做的培养基来生长培养基配制的方法是：称出200g克淀粉放在1000mL水里，再煮半小时。然后，加入20g葡萄糖和少量豆油，再加入少量黄豆饼粉和无机盐，这就做成了简易的链霉菌液体培养基。培养基做完后在培养之前进行灭菌，可以采用高温灭菌在121℃ ，0．1MPa下灭菌半小时，即可达到灭菌的效果，等冷却后，将菌种接进瓶子里的马铃薯培养基里。瓶口立即用纱布包好（不要包牛皮纸）。包好以后把瓶子放到25-30℃的地方培养1-2天，