弥漫性大B细胞淋巴瘤中PI3KAKT信号通路抑制对肿瘤细胞生长及化疗敏感性影响的体内外研究课件.pptVIP

弥漫性大B细胞淋巴瘤中PI3K/AKT信号通路抑制对肿瘤细胞生长及化疗敏感性影响的体内外研究 于宝华，周晓燕，施达仁复旦大学附属肿瘤医院病理科 研究背景 弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL） 最常见的NHL 异质性的肿瘤 Institutional cases of FUCH (2006~2007, total case number 789) PI3K/AKT/mTOR信号通路 乳腺癌、 卵巢癌、 DLBCL? 体外研究 Western Blot 法 DLBCL细胞株中AKT活化状态 用LY294002分别 作用于3株细胞 LY294002、DOX、 两者联合及序贯 作用于细胞株 观察pAKT水平的改变及 细胞生物学行为的改变 检测干扰后细胞凋亡等的变化 研究内容 体内研究 腹腔注射不同剂量LY294002和对照 观察不同浓度LY294002对肿瘤生长的抑制作用； Western blot方法检测pAKT和AKT蛋白表达 用LY8细胞株建立皮下移植瘤裸鼠模型 腹腔注射LY294002、DOX、 LY294002+DOX 同前观察不同用药组肿瘤生长的 抑制情况 材料与方法 细胞及动物 人DLBCL来源的LY1、LY8、LY10细胞株 BALB/c裸鼠 统计分析 —— 采用SPSS11.5软件进行统计学分析。 多样本计量资料比较：单因素方差分析。 结 果-体外 10％FBS Serum-Free Ly1 ly8 ly10 ly1 ly8 ly10 pAKT（ser473） AKT GAPDH Western blotting显示DLBCL细胞株ly1、ly8和ly10中Akt和pAkt状态 DMSO 10 20 30 50 100 DMSO 10 20 30 50 100 DMSO 10 20 30 50 100μΜ pAKT (ser473) a b c 不同浓度LY294002作用1h对DLBCL细胞株中pAkt的抑制作用 AKT GAPDH 三株细胞在LY294002作用48h后细胞周期分布变化及 不同时间点S期抑制作用分析 结 果- 体外 LY294002 、Doxo 、Doxo+ LY294002及两者序贯使用后 流式细胞分析不同时间三株细胞中凋亡细胞比例变化分析 1．皮下移植瘤模型的建立 D14左右（D10-20）： 接种部位皮下有肿瘤长出。 截至传至第9代时共移植裸鼠124只，成瘤率约91.1%。 细胞株接种 D21左右： 见有肿瘤长出， 约5×6mm， 扁平质软 D34： 肿瘤长至 10×10mm 无 菌 套 管 针 法 鼠 间 种 植 结 果- 建模 2．移植瘤生长特点 A、B、C分别为第8代裸鼠 接种后第19、26、34天。 第8代移植瘤生长曲线 第1代至第8代生长曲线均类似 结 果- 建模 3．大体观察 第8代荷瘤鼠接种后28天 肿瘤直径约2cm；切面示灰白灰红，鱼肉状，质地软，可见坏死。 结 果- 建模 LY294002对皮下移植瘤生长的影响 动物分组与干预 30只荷瘤鼠（200-400mm3 ）随机分为3组： 对照组、低剂量LY294002组（0.1mg/kg）、高剂量LY294002组（0.5 mg/kg） 每天给药，共连续10天。 实验观察 移植瘤体积（体积＝1/2ab2）：每周3次 质量抑瘤率和体积抑瘤率 IHC检测Ki67表达； 细胞增殖指数（PI）：运用Motic Images Advanced 3.2 软件对Ki67的阳性范围进行分析 蛋白质提取，Western Blot检测pAKT表达 1．LY294002对肿瘤生长的影响 结 果-抑瘤 移植瘤在用药起始第6天时几乎消失。 2.1 生长曲线 D3 D6 D8 D11 D13 高剂量组 明显 （p=0.038） （p=0.004） （p=0.005） （p=0.016） 最显著 （p0.00