念珠菌病诊治与念珠菌鉴定课件.pptVIP

培养后鉴定—分子鉴定 PCR-EIA RLB,AFLP,SSCP,RAPD 基因芯片 PNA-FISH (fluorescein-labeled peptide nucleic acid fluorescent in-situ hybridization) 26S rRNA, Candida albicans, C.glabrata sensitivity :100%, specificity: 100% JCM,2002,40:2182-2186 核糖体基因 SSU 5.8S ITS2 LSU ITS1 D1/D2 IGS2 IGS1 5S - General presence (involved in cell replication). - Not protein-coding, no evolutionary pressure. - Multicopy. - No gene family. - (Very) variable and (very) conserved domains. rRNA(rDNA)gene -Small Subunit (SSU) rDNA (18S) -Large Subunit (LSU) rDNA (26S, 28S) -Internal Transcribed Spacer (ITS) -Intergenic Spacer (IGS) 常选用的基因 Hybridization Buffer with PNA probe 90 min. at 55℃ Hybridization Wash solution 30 min. at 55℃ 1×Wash Mounting medium 2 min. at RT Mounting 2 min. at RT Examination PNA- FISH procedure Hybridization Candida albicans--- fluoresent (in situ) hybridization (FISH) with SSU rDNA probe Zhu et al. AAA. San Francisco, 9-12th September 2004 Chip and probe: Candida spp. Aspergillus spp. Clinical samples: 10-20 cfu/ml body fluid PCR electrophoresis: 75.6% DNA microarray: 87.9% Gene chip--DNA Microarray Clinical sample A. DNA extraction B. PCR labeling C. SMART oligo array D. Hybridization E. Detection F. Diagnosis SMART principle * * MALDI-TOF MS技术 获取谱图 数据分析 样品处理 上机检测 未知病原菌 微生物鉴定流程 挑取菌落 * 鉴定方法 用时 成本 （元/个） 操作复杂程度 通量 传 统 方 法 表型鉴定法 7-14天 200 操作复杂，需专业人员 低 16rDNA鉴定法 1-2天 80 操作复杂，需专业人员 低 DNA-DNA杂交法 1-2天 1000 操作复杂，需专业人员 5个/天 脂肪酸组分分析法 1-2小时 1000 需专业人员 10个/天 MALDI-TOF MS 技术 3-5分钟 4 操作简单，自动化处理 400个/天 MALDI-TOF MS技术与其他微生物鉴定技术比较 MALDI-TOF MS技术：耗时短、成本低、通量高 “Proteomic phenotyping is revolutionizing diagnostic mycology as fully reflecting species/morph varieties but often overcoming taxonomic hindrance.” Chierico FD et al. J of Proteomics 2012;75:3314-30. 小结—酵母菌鉴定依据 传统 菌落颜色、外观 镜下细胞形态、大小 有无荚膜 有无假菌丝和菌丝 芽管形成和厚膜孢子形成 碳源同化、发酵 氮源同化、发酵 现代 辅酶Q系统 同功酶 血清学 基因分型技术 MALDI-TOF技术 increases the yield of C