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实验4 叶绿体色素的提取、分离、理化性质和叶绿素含量的测定 实验目的：掌握植物中叶绿体色素的成分分离和定性、定量分析的原理和方法。 一、实验原理 2、吸附性。滤纸对Chl b、Chl a、叶黄素的胡萝卜素的吸附能力不同(？)，当用石油醚作推动剂时，其在滤纸上的移动速度不同，可相互分离。 4、取代反应。 在酸性或加温条件下，叶绿素卟啉环中的Mg++可依次被H+和Cu++取代形成褐色的去镁叶绿素和绿色的铜代叶绿素。 H+取代Mg2+, Cu2+ (Zn2+)取代H+ 。 5、叶绿素受光激发，可发出红色荧光，反射光下可见红色荧光。 6、定量分析。叶绿素吸收红光和蓝紫光，红光区可用于定量分析，其中645和663用于定量叶绿素a,b及总量，而652可直接用于总量分析。 材料： 菠菜。 三、方法和结果： 1．定性分析： 鲜叶5g+95%30ml（逐步加入）,磨成匀浆 ? 2．叶绿素定量分析： 鲜叶0.1g，加1.9mlH2O，磨成匀浆，各取0.2ml加80%丙酮4.8ml,摇匀，4000转离心3min,上清液在645，652，663测定OD，计算Chla,Chlb 和Chl总量的值。 四、结果计算 Ca(mg/L)=12.7OD663-2.69 OD645 Cb (mg/L) =22.9OD645-4.68 OD663 CT (mg/L) = Ca+ Cb=OD652?1000/34.5 Chla含量(mg/g.FW)= （Ca(mg/L)/1000） ?2/ 0.1 ?5/ 0.2 Chlb含量(mg/g.FW) = （Cb(mg/L)/1000） ?2/ 0.1 ?5/ 0.2 Chl总含量(mg/g.FW) = （CT(mg/L)/1000） ?2/ 0.1 ?5/ 0.2 五、分析讨论 * 1、溶解性。叶绿素和类胡萝卜素均不溶于水而溶于有机溶剂，常用95%的乙醇或80%的丙酮提取。 ？ ？ ？ ？ C32H30ON4Mg COOCH3 COOC20H39 + 2KOH C32H30ON4Mg COO— COO— + 2KOH +CH3OH +C20H39OH 3、皂化反应。叶绿素是二羧酸酯，与强碱反应，形成绿色的可溶性叶绿素盐，就可与有机溶剂中的类胡萝卜素分开。 ？ ？ C C C C N C C C C N C C C C N C C C C N HH C CH HC C CH2 CH CH3 R1— H2C H3C— —CH3 C C C C N C C C C N C C C C N C C C C N Cu C CH HC C CH2 CH CH3 R1— H2C H3C— —CH3 褐色 绿色 透射光下呈绿色 反射光下呈红色 a b Relative absorbtance Waverlength(nm) 过滤入三角瓶中 观察荧光现象 透射光 色，反射光 光。 色素分离 在滤纸中心缓慢滴入30滴提取液 略干后滴入石油醚直到接近滤纸边缘 用笔注出成分和颜色结果附于实验报告中。 皂化反应 加KOH数片剧烈摇均，加石油醚5ml和H2O 1ml 分层后观察 上层呈 色，为 ，吸收 光。 下层呈 色。为 。吸收 光。 取代反应（1） 加醋酸约2ml，变褐（ 叶绿素）取1/2加醋酸铜粉加热变 色， 为 叶绿素。 取代反应（2）： 鲜叶2-3cm2，加Ac-AcCu 20ml加热。观察： min变为 色的 叶绿素， min后，变为 色的 叶绿素。 *