2010年第2章 基因工程3.ppt

2. cDNA文库的构建 cDNA第二链的合成之二 2. cDNA文库的构建 双链平头cDNA的克隆 2. cDNA文库的构建 三、酵母双杂交系统 1. 酵母双杂交系统的基本原理 酵母双杂交系统是由Fields和song 在20世纪90年代建立起来研究蛋白质相互作用的技术手段。 基本原理：真核生物的转录激活子一般是由两个结构上分开的、功能上相互独立的结构域组成，即一个DNA结合域（BD）和一个转录激活域（AD）。BD为识别位于靶基因上游的一个特定区段，并与之激活；AD则同其他成分结合来启动下游基因的转录。 一般情况下它们是同一种蛋白质的两个组成部分，是激活基因转录的必要条件，分开单独存在时仍具有其原来的功能，但不能其始转录。 1. 酵母双杂交系统的基本原理 这个方法主要由4个部分组成：AD、BD、报告基因和诱惑基因组成。 AD和BD可来自同一个转录激活子的两个结构域，也可来自两种不同转录因子结构域的不同部分，但在体内其他蛋白质相互作用下都可以重新连接成转录因子，并具有转录功能，激活下游报告基因的表达。 常见的AD和BD来自于Gal4和LexA，下游报告基因的表达产物一般会引起荧光或显色反应，易于检测。 1. 酵母双杂交系统的基本原理 1. 酵母双杂交系统的基本原理 1. 酵母双杂交系统的基本原理 1. 酵母双杂交系统的基本原理 两种载体在构建融合基因时，测试蛋白基因与结构基因必须在阅读框内融合，融合基因的表达产物只有定位于核内才能驱动报告基因的转录。 Gal4-BD具有核定位信号；Gal4-AD无，故在其氨端或羧端克隆有来自SV40的T抗原一段序列作为核定位序列。 常用的BD基因有：LexA和Gal4的BD编码序列；常见的AD基因有：VP-16和Gal4。 2. 酵母双杂交系统的应用 （1）鉴定已知蛋白质之间是否相互作用 将两个待测蛋白的基因分别同BD或AD结构域融合，共转酵母后，如果两个蛋白能相互作用，那么它们的结合会导致两个结构域的结合，从而启动报告基因的转录。 * * 4. 基因工程-常规技术(下) 中南大学资源加工与生物工程学院 基因工程的常规技术 一、生物芯片 基因芯片 蛋白芯片 二、基因文库构建 基因组文库构建 cDNA文库构建 三、酵母双杂交系统 酵母双杂交系统的基本原理 酵母双杂交系统的应用 四、DNA测序 一、生物芯片 生物芯片 生物芯片：生物芯片是20世纪80年代，随着人类基因组计划的进行而诞生的一项在分子生物学领域中迅速发展起来的技术。它是将细胞、蛋白质、DNA或其他生物组分，通过微加工技术和微电子技术点在一个小的固体芯片表面，以实现对它们的准确、快速、大信息量的检测分析。其包括基因芯片、蛋白芯片、细胞芯片、组织芯片等。 “The use of biochips in scientific research and drug discovery has become so widespread that its almost impossible now to imagine how we got along without them. ” ————P.O.Brown 1. 基因芯片 基因芯片，也称为DNA芯片，DNA阵列（DNA array），就是在玻片、硅片和薄膜大呢感载体的基质表面上有序地、高密度地排列、固定了大量的靶DNA片段或寡核苷酸片段。这些被固定的DNA分子在基质上形成了高密度的DNA阵列，因此也叫基因微阵列（microarray）。 横跨：生命科学、物理学、计算机科学、微电子技术、光电技术、材料科学等现代高科技。 1. 基因芯片 基因芯片根据固定在玻片上的DNA类型，可分为3种：cDNA芯片、寡核苷酸芯片、基因组芯片。 样品核酸分子经过标记（荧光或同位素）作为探针，与固定在载体上的DNA同时进行杂交，杂交信号通过扫描仪输入计算机，用特定的软件分析杂交信号的强弱，判断分子的数量和与探针的同源性，进而获得样品的序列信息而对基因序列及功能进行大规模、高通量地研究。 杂交属于固-液杂交，高度集约化和平行处理。 1. 基因芯片 基因芯片的图象 6400点的基因芯片的图象（12X14mm） 1. 基因芯片 1. 基因芯片 基因芯片数据分析 （1）直接将核酸片段“点”至包被过的芯片表面做探针片段； （2）预先合成寡核苷酸，再将其固定至芯片表面作为探针片段； （3）原位合成寡核苷酸探针片段。 1. 基因芯片 基因芯片的制备方法 基因芯片点样仪 运用基因芯片技术研究肿瘤相关基因 基因芯片DNA分子的相互作用 1. 基因芯片 1. 基因芯片 基因芯片DNA分子的相互作用 2. 蛋白芯片 蛋白芯片以蛋白质代替D