第5章 将DNA引入活PPT.ppt

* 第五章 将DNA引入活细胞（受体细胞） 受体细胞：从实验技术上讲是能摄取外源DNA并使其稳定维持的细胞。从实验目的上讲是有应用价值和理论研究价值的细胞。 受体细胞的选择所遵循的原则： 1）便于重组DNA的导入 2）能使重组DNA稳定的存在于细胞中。 3）便于重组体的选择。 4）遗传稳定性高。 5）安全性高，无致病性。 6）受体细胞在遗传密码的应用上无明显的偏好。 重组DNA分子引入活细胞，随着活细胞的生长和分裂产生克隆 克隆的目的 A)产生大量的重组DNA分子 B）纯化目的分子 连接产物中包含的分子类型： 未连接的载体分子 未连接的DNA分子 自连的载体分子 重组的DNA分子 携带插入错误DNA片段的重组分子 5.1 转化—使细菌细胞获取DNA 转化：指重组质粒DNA分子通过与膜蛋白结合进入受体细胞，并在受体细胞内稳定维持与表达的过程。 5.1.1 不同种类的细菌获取DNA的效率不同 自然条件中，外源DNA被细菌吸收后，会被降解 1)裸露的线性DNA分子，易遭到核酸酶的攻击 2）细菌细胞具有修饰限制系统，识别自我和非我的DNA分子 正常状态下的细菌细胞获取外源DNA的能力有限 感受态细胞能增强获取外源DNA能力的可能机理： Ca 2+离子与细胞膜磷脂层形成液晶结构、促使内外膜之间核酸酶解离形成感受态。 Ca 2+离子能与DNA结合形成形成羟基——磷酸钙复合物（抵抗DNAase）并能吸附在细胞外膜表面上。 热击破坏液晶结构，细胞膜结构出现间隙，为DNA分子提供进入细胞的通道。 5.1.3 对转化细胞的选择（含目标质粒的细胞） 通过质粒所携带基因的表达情况来进行检测 大都数的质粒克隆载体赋予寄主细胞耐受抗生素的表型，通过寄主细胞获得的表型来进行筛选 细胞转化后的复苏阶段的目的：培养细胞产生足够多的分解抗生素的产物，利于后续的在平板中的生长。 5.2 重组体的鉴定 转化子：导入外源DNA后能稳定存在的受体细胞。 重组子：含有重组DNA分子的转化子。 阳性克隆：含有目的DNA的重组子。 通过各种方法将DNA导入受体细胞后，获得所需阳性克隆的过程称为筛选。 通过载体上携带的基因特点来进行筛选：如抗性标记、插入失活、插入表达、颜色互补等。 5.2.1 pBR322重组体的筛选—抗生素抗性基因的插入失活 在BamHI 位点插入外源DNA分子，就不再赋予寄主细胞耐受四环素的性质 重组的pBR322分子保持氨苄青霉素抗性，为ampRterr 筛选重组的pBR322分子的方法（p83） 缺点：需要两轮筛选 5.2.2 α互补（蓝白斑筛选，LacZ互补） 正常野生型的大肠杆菌编码能利用乳糖的基因，包含LacZ基因，编码?-半乳糖苷酶（乳糖操纵子的结构） 基因工程的工程菌通常将该基因修饰，使其缺少编码?-半乳糖苷酶α-肽段的序列 在载体上加入一段含编码?-半乳糖苷酶α-肽段LacZ’基因 如果载体上的LacZ’基因不被破坏（未插入外源DNA分子），通过载体与宿主细胞中两段基因产物的互补，可形成有活性的?-半乳糖苷酶 5.2.2 α互补（蓝白斑筛选，LacZ互补） 在实验过程中，加入乳糖类似物X-gal，被?-半乳糖苷酶分解可产生蓝色的化合物 由于载体上具有抗生素抗性基因，赋予了宿主细胞抗生素抗性能力，因此在这类的克隆中？ 当载体上的LacZ’基因被破坏（插入了外源DNA分子），不能形成有活性的?-半乳糖苷酶，因此在这类克隆中具备？ 5.2.2 α互补（蓝白斑筛选，LacZ互补） α互补（蓝白斑筛选，LacZ互补） 5.3 将噬菌体DNA引入细菌细胞 5.3.1 转染(transfection): 类似质粒的转化，将重组的λ噬菌体DNA分子导入到受体细胞内并稳定遗传的过程。 5.3.2 λ克隆载体的体外包装 体外包装： 模拟λ噬菌体DNA分子在宿主细胞内发生的包装过程，将重组的λ噬菌体DNA分子包装成成熟的具有感染能力的λ噬菌体颗粒 必要性： λ噬菌体重组分子直接感染大肠杆菌的效率较低，而在试验过程中，因内切酶的处理，DNA的连接产生的有效分子等原因，使得转染效率更低 5.3.2 λ克隆载体的体外包装 5.3.2 λ克隆载体的体外包装 单菌株体系 缺陷型λ噬菌体在cos位点有突变， λ噬菌体的DNA复制不能完成，但可形成外壳蛋白，可以制备包装所必须的各种外壳蛋白。 *