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柯萨奇病毒的RT-PCR实验PPT
柯萨奇病毒的RT-PCR实验室诊断;属于小RNA病毒科肠道病毒属,最易在灵长类动物细胞中生长。
病毒分为A、B两组。柯萨奇病毒A组有23个血清型,柯萨奇病毒B组有6个血清型。;柯萨奇病毒(Coxsackie virus,CV ) 的诊断方法:
病毒分离、动物接种
操作烦琐, 成功率低, 影响诊断的敏感性;
ELISA 法
检测患者血清中相应的特异性IgM 、 IgG抗体, 但不能获得有关病毒更多的信息;
RT - PCR 法
既可以通过检测病人样本中的病毒RNA 来明确诊断, 也可以通过进一步的测序来分析病毒流行株特定序列, 为基因分型提供依据。;两端为保守的非编码区,中间为编码区。5’端共价结合一小分子蛋白质Vpg(约7kDa),与病毒RNA合成和基因组装配有关;3’端带有polyA尾。编码区编码的病毒结构蛋白VP1~VP4,VP1、VP2和VP3均暴露在病毒衣壳的表面,有中和抗原位点;VP4位于衣壳内部,一旦病毒VP1与受体结合后,VP4即被释出,衣壳松动,病毒基因组脱壳穿入。;逆转录PCR,或者称反转录PCR(reverse transcription-PCR, RT-PCR),是聚合酶链式反应(PCR)的一种广泛应用的变形。在RT-PCR中,由一条RNA单链转录为互补DNA(cDNA)称作“逆转录”,由依赖RNA的DNA聚合酶(逆转录酶)来完成。一条RNA链被逆转录成为互补DNA,再以此为模板通过PCR进行DNA扩增。
;RT-PCR实验程序:标本的采集、标本RNA的提取、引物、RT-PCR反应体系、温度循环参数、琼脂糖电泳、凝胶成像、结果判定及序列测定;一步法:反转录PCR在一个管子里完成,得到的全部cDNA产物都一起经PCR扩增,灵敏度更高。
两步法:反转录和PCR分开,灵活而且严谨,但灵敏度不如前者高。
;RNA操作注意事项;PCR反应系统的组成:
⑴耐热DNA聚合酶(Taq酶):这是由耐热水生细菌体内提取的一种DNA聚合酶。
⑵模板DNA:即待分析的目的DNA,其长度不宜大于10kb。
⑶两种引物:为了保证DNA聚合酶能够对两条互补链均能进行延伸,需要两种引物,分别位于两条互补模板DNA链的3`-端。
⑷四种脱氧核糖核苷酸:用作底物的dNTPS。
⑸缓冲溶液:保证DNA聚合酶催化时所需的适当的溶液pH值; PCR技术类似于DNA的天然复制过程,其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成:
①模板DNA的变性:模板DNA经加热至93℃左右一定时间后,使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备;
②模板DNA与引物的退火(复性):模板DNA经加热变性成单链后,温度降至55℃左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合;
③引物的延伸:DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链。重复循环变性--退火--延伸三过程,就可获得更多的“半保留复制链”,而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2~4分钟,2~3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。到达平台期(Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。;PCR 注意事项;模 板;引 物;Mg2+ 酶;物理原因;出现片状拖带或涂抹带;如何避免污染;TRIZOL法提取核酸
RT-PCR法检测柯萨奇病毒(两步法)
逆转录(RT)
聚合酶链反应(PCR)
PCR产物的检测和鉴定
引物:CVB3的3D基因引物
;TRIZOL法提取核酸
1)取250ul病毒悬液加到1.5ml离心管中,然后加入750ul TRIZOL溶液,混匀5秒后离心。
2)加入200ul 氯仿溶液,充分混匀5秒钟
3)室温放置10分钟后,10000RPM,室温离心20分钟
4)将上清液转移到一支新的1.5ml离心管中
5)再加入500ul异丙醇溶液,摇匀10秒钟
6)室温静置至少15分钟
7)14000RPM,4℃离心25分钟
8)倒掉上清液,加入950ul冰冷的70%乙醇
9)14000RPM,4℃离心20分钟
10)用吸尖小心吸出上清液倒掉
11)室温干燥后加入15ul dH2O,-70℃保存; 逆转录(RT)
配液:RNA 3μl(1μg)
随机引物 1μl 加水至10μl
混匀,瞬时离心,70℃ 5min
立即冰水浴,瞬时离心,依次添加下列试剂
M-MLV Buffer 5×
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