云南省个旧市女性宫颈HPV感染及基因分型研究.docVIP

云南省个旧市女性宫颈HPV感染及基因分型研究 　　[摘要] 目的 分析云南省个旧市妇女HPV感染状况，探讨HPV感染与宫颈病变程度的关系。 方法 用导流杂交基因分型技术对2 058例有性生活妇女的宫颈脱落细胞标本进行21种HPV基因分型检测。 结果 2 058例标本中有20种HPV亚型被检测出，HPV总感染率为23.9%，高危型占76.0%，低危型占24.0%，检出前五位亚型依次为HPV52、16、58、18和CP8304。宫颈病变组HPV感染率、高危型HPV及HPV16亚型感染率显著高于病理检查正常组，且随宫颈病变程度的加重感染率显著增高（P 　　[关键词] 人乳头瘤病毒（HPV）；宫颈病变；基因分型 　　[中图分类号] R730.261[文献标识码] A[文章编号] 1673-9701（2012）12-0001-03 　　宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率在全球妇女肿瘤中仅次于乳腺癌，位居第2位。HPV感染与宫颈肿瘤的发生、发展密切相关，高危型HPV的持续性感染是导致宫颈癌及癌前病变的主要致病因子，约20种以上的HPV亚型与宫颈癌的形成有关，且不同的地区、不同的种族HPV的感染率和亚型分布有所不同，导致宫颈病变的发生及病变程度有所差异。因此明确HPV在特定地区及不同病变宫颈组织的感染率及亚型分布差异，对HPV所致疾病的防治及HPV疫苗开发应用有着重要的指导意义。为了解云南省个旧市HPV感染状况及亚型分布规律，本研究采用导流杂交基因芯片技术对2 058例妇科首诊人群的宫颈脱落细胞标本进行21种HPV基因分型检测，探讨HPV亚型感染与宫颈病变发生发展的关系，为本地区宫颈癌的预防、高危人群筛查和特异性疫苗的研制提供一定的实验依据。 　　1 对象与方法 　　1.1 研究对象 　　2 058例标本取自2010年6月～2011年9月我院妇科首诊患者，年龄19～75岁，平均（40.5±9.1）岁。患者纳入标准：①未行子宫切除手术；②就诊时处于非妊娠状态；③就诊前48 h内无性生活；④就诊前24 h内无阴道处理。所有研究对象均知情同意并自愿参加。按病理确诊结果分为病理检查正常组（354例）、慢性宫颈炎组（77例），宫颈上皮内瘤变组（包括CINⅠ、Ⅱ、Ⅲ）（44例）和宫颈癌组（16例）。 　　1.2 方法 　　1.2.1 标本采集及保存由医生以窥阴器或阴道张开器暴露宫颈，用棉签擦去宫颈分泌物，然后使用专用的HPV采样刷置于宫颈口2~3 cm，顺时针旋转3~5圈，慢慢取出宫颈刷，将其放入有专用细胞保存液的样本管中，折断多余的刷柄，拧紧瓶盖，注明编号和日期。置于4℃存放，并在一周内完成检测。 　　1.2.2 HPV分型①DNA提取：取保存有宫颈细胞的细胞保存液0.5 mL，以14000 r/min离心5 min，弃上清液后，用DNA提取试剂盒提取标本DNA。②PCR扩增：PCR反应体系为25 μL，包含：23．25 mL PCR-Mix，0．75 μL DNATaq酶，1 μL DNA模板。凯普基因扩增仪扩增程序为：95℃预变性9 min；95℃20 s→55℃30 s→72℃30 s共40个循环，72℃延伸5 min。③杂交过程：导流杂交前，将PCR扩增产物热变性95℃ 5 min，然后冰水浴≥2 min，同时将固定有核酸探针的膜固定在杂交仪上，加入0.8 mL杂交液预杂交≥2 min后排干，加入0.5 mL杂交液，把PCR产物加到薄膜上与杂交液混匀，进行导流杂交≥10 min，清洗除去未结合的DNA，整个杂交过程保持在45℃。预封阻后用封阻液封闭膜，孵育5 min，排出封阻液后加入酶标液，25 ℃温育3.5 min。④显色过程：用A液彻底冲洗膜，除去未结合的酶标液后，加入NBT/BCIP底物显色3～5 min后B液洗膜3次，蒸馏水清洗后1 h内分析结果。通过导流杂交技术一次检测HPV共21个HPV亚型，包括高危组15个亚型：16、18、31、33、35、39、45、5l、52、53、56、58、59、66和68型；低危组6个亚型：CP8304、6、ll、42、43和44型。 　　1.2.3 统计学方法采用SPSS 11．0统计软件处理，组间比较采用χ2检验，P?0.05为有统计学意义。 　　 　　2 结果 　　2.1 HPV分型结果图 　　导流杂交膜上内对照点和Biotin对照点必需为阳性，阴性对照均不显色。HPV单一感染时，在导流杂交膜芯片上相应HPV亚型探针位点处可见一蓝紫色斑点，双重或多重感染时，在膜上可见2个或2个以上显色斑点。见图1、2、3。 　　2.2 HPV感染状况分析 　　2 058例标本经HPV基因分型诊断筛查出491例HPV感染阳性，HPV感染率为23.9%，各组HPV