鱼精蛋白prm基因遗传变异及其对种公牛精液品质影响-genetic variation of protamine prm gene and its effect on semen quality of bull.docxVIP

山东师范大学硕士学位论文 山东师范大学硕士学位论文 万方数据 万方数据 万方数据 万方数据 目 录 摘 要 I ABSTRACT IV 英文缩写说明 VII 第一章 文献综述 1 1 中国公牛精液品质性状研究的选育概况1 2. PRM 基因研究进展 2 3 mRNA 的可变剪切 4 4.启动子活性研究7 第二章 中国荷斯坦公牛 PRM2 基因多态性研究 9 1 试验材料和方法9 2 结果与分析15 3 讨论19 第三章 中国荷斯坦公牛 PRM2 基因转录本的表达研究 20 1 试验材料和方法20 2 实验结果23 3 讨论28 1 材料和方法30 2 结果与分析35 3 讨论38 第五章 中国荷斯坦公牛 PRM1 基因可变剪接体研究 40 1 材料和方法40 2 结果分析41 3 讨论45 结论 46 参考文献 47 致谢 53 硕士期间发表的文章 54 i 山东师范大学硕士学位论文 山东师范大学硕士学位论文 山东师范大学硕士学位论文 山东师范大学硕士学位论文 万方数据 万方数据 万方数据 万方数据 鱼精蛋白 PRM 基因遗传变异及其对种公牛精液品质的影响 摘 要 种公牛在奶牛群的遗传改良中起着关键性的作用，其精液品质高低不仅是决定种 公牛站经济效益的关键因素，更是影响奶牛受胎率的重要因素。公牛精液品质性状受 遗传、环境、营养和饲养管理等多种因素的影响。仅依靠营养、饲养管理及常规育种 的手段，来提高公牛的精液品质性状难度很大，且目标周期长、效率低。公牛的精液 品质性状属于数量性状，受多基因调控，且精子发生过程复杂，筛选和精液品质性状 相关的主效基因或关键调控位点对于提高公牛的精液品质性状显得极为重要。 鱼精蛋白在精细胞中是主要的核蛋白，与雄性生殖紧密相关，对精子的发育以及 正常功能形成产生了重要的影响。鉴于此，本研究选择鱼精蛋白 PRM 基因(PRM1 和 PRM2)为候选基因，从基因转录形成的可变剪切体、基因的启动子活性、功能性 SNPs 鉴定及其相关性分析等方面来研究这些遗传变异对种公牛精液品质性状的影响，并尝 试分析影响公牛精液品质性状的分子调控机理。主要研究结果分述如下： 1.中国荷斯坦公牛 PRM2 基因多态性研究 中国荷斯坦公牛 PRM2 基因的多态性的筛查是基于 DNA 直接测序和软件比对技 术进行的，在外显子 2 处检测到一个错义突变的新 SNP g.+478 A G，在编码氨基酸 时将精氨酸（R）错义为甘氨酸（G）。本实验通过 PCR-RFLP 技术对 g.+478 A G 位 点进行基因分型，并将各个基因型与公牛精液品质的关联性进行分析。结果发现，g.478 A G 位点突变纯合基因型 GG的个体的采精量、鲜精活力、冻后活力和鲜精密度显著 高于野生纯合型AA和杂合型AG(P＜0.05)，畸形率也显著低于二者(P＜0.05)。因此， GG 型个体的精液品质较好，GG 可作为有利的分子标记用于高繁殖力公牛的辅助选 育。 2.中国荷斯坦公牛 PRM2 基因可变剪接体研究 为了研究 PRM2 基因可变剪切体在不同组织中的表达模式以及在大小公牛睾丸组 织中的差异性表达。本实验采用 RT-PCR 技术检测了 PRM2 基因总 mRNA 在不同组织 中的表达，并采用 qRT-PCR 方法检测 PRM2 基因两个转录本即全转录本 PRM2-CT 和 可变剪切本 PRM2-TV1 在大小牛睾丸组织中的相对表达量。RT-PCR 结果显示， PRM2-CT 和 PRM2-TV1 在大牛和小牛中均只在睾丸组织中有表达，在心脏组织、肝 I 脏组织、脾脏组织、肺组织和肾脏组织中均不表达。qRT-PCR 结果表明 PRM2-CT 和 PRM2-TV1 在成年公牛睾丸中的表达量比小牛睾丸中的表达量高，且在大小公牛睾丸 组织中均显示 PRM2-TV1 的表达量显著高于 PRM2-CT 表达量(P0.05)。此外，该试 验也说明 PRM2-TV1 是转录调控过程中的主转录本。 .中国荷斯坦公牛 PRM1 基因启动子和功能性 SNP 的鉴定 本试验通过生物信息学预测到 PRM1 基因存在一个启动子区，且通过基因扩增发 现在该启动子区存在 g.-138.A G 和 g.-111.G A 2 个 SNPs，这两 SNPs 位点呈现完全 连锁，因此可将其看作为一个整体 SNP-1（g.-138.A G）进行遗传研究。此外，还发 现 g.-138.A G 位点的突变可以使 NF-Zc 和 H4TF-2 转录因子结合位点消失，而以往 的研究发现 NF-Zc 和 H4TF-2 结合因子具有促进基因转录的功能。通过 PRM1 基因启 动子区缺失片段的克隆，构建出连接不同片段的含荧光素酶报告载体的质粒，然后将 这些质