gluk2psd95信号模块通过fas信号通路介导缺血性神经元损伤及机制的研究-gl uk2 psd 95 signal module mediates ischemic neuronal damage and its mechanism through fas signal pathway.docxVIP

中文摘要研究背景和研究目的缺血再灌注过程中，谷氨酸过度释放造成的神经兴奋毒作用是缺血性脑损伤 的重要机制。谷氨酸受体 GluK2 亚基被过度激活后，通过脚手架蛋白 PSD-95 与酪 氨酸蛋白激酶 MLK3 结合，形成 GluK2- PSD-95- MLK3 信号模块。在此模块中， MLK3 通过交叉磷酸化而将自身激活，并作用于其下游底物，通过 MAPK 信号级 联，最后激活转录因子 c-Jun，引起 FasL 表达增加。这就是所说的 MAPK 信号通 路介导凋亡的核通路。Fas 是重要的死亡受体，FasL 表达的增加提示 FasL-Fas 信 号通路在 GluK2-PSD-95 信号模块介导的缺血性脑损伤中发挥终极作用。然而 Fas 信号通路是否真的在 GluK2-PSD-95 信号模块介导的缺血性脑损伤中发挥重要作 用，以及 Fas 介导缺血性脑损伤的具体机制目前并不很清楚。Fas 凋亡信号通路广泛存在于各种组织细胞。Fas 被配体 FasL 激活后，其胞内 区与 FADD 结合，并通过 FADD 募集凋亡蛋白 caspase 8，组装成 DISC 复合体。 在此复合体中，caspase 8 自身裂解活化，继而启动 caspase 信号级联或刺激线粒体 释放 Cyt c 而激活凋亡执行蛋白 caspase 3，引起 DNA 水解和细胞凋亡。Fas 凋亡 信号通路中的信号分子受到多种机制的调节。Fas 的巯基亚硝基化修饰能够促进其 由胞浆向胞膜转位，并在胞膜上聚集成高分子量的聚合体 CD95hi，同时向胞浆内 化。CD95hi 能够与 FADD 和 caspase 8 组装成 hiDISC，hiDISC 是 Fas 介导凋亡的 更主要形式。本研究分两个部分，分别利用 PSD95 的 PDZ1 抑制性环肽和 Fas shRNA，采 用生物化学和组织染色的方法，证明 GluK2-PSD-95 信号模块通过 Fas 信号通路介 导缺血性神经元损伤；利用生物化学的方法，研究 NO 供体 GSNO 保护缺血再灌 神经元的机制，从而反映 Fas 信号通路介导缺血性脑损伤的机制。第一部分 GluK2-PSD-95 信号模块通过 Fas 信号通路 介导缺血性神经元损伤方法1.用 TUN EL 法，检测 PDZ1 环肽阻断 GluK2-PSD-95 结合后，再灌注 5d大 鼠海马 CA1 区锥体神经元凋亡情况的变化。2.用免疫荧光方法，检测 PDZ1 环肽对缺血再灌过程中 Fas 和 FasL 表达的影 响；用免疫印迹和免疫沉淀的方法，检测 PDZ1 对缺血再灌过程中 DISC 组装和下 游信号蛋白活化的影响。3.用 DAPI 染色法检测 Fas shRNA 对 OGD 后原代大鼠海马神经元凋亡的影响。结果1.TUN EL 检测显示，缺血前给予 PDZ1 环肽显著减少了大鼠海马 CA1 区神经 元的凋亡。2.缺血前给予 PDZ1 环肽显著抑制了再灌 6h FasL 表达的增加、DISC 的组装和 下游凋亡蛋白的激活，但是对 Fas 表达没有明显影响。3.OGD 前给予 Fas shRNA 显著减少了复糖复氧过程中原代海马神经元的凋亡。第二部分 GSNO 通过抑制 Fas 巯基亚硝基化和 Fas 信号转导 在缺血性脑损伤中发挥神经元保护作用方法1.用焦油紫染色方法，检测大鼠全脑缺血前给予 GSNO 对海马 CA1 区神经元 死亡的影响。2.用免疫印迹的方法，检测 GSNO 对缺血再灌注过程中凋亡相关蛋白活化的影响。.用生物素转化法，检测缺血再灌注过程中 Fas 巯基亚硝基化的变化，及缺血 前给予 GSNO 对 Fas 巯基亚硝基化的影响。.用生物素转化法，检测缺血前给予 GSNO 对 nNOS 巯基亚硝基化的影响；NOS 活性检测试剂盒和 NO 检测试剂盒检测 GSNO 对 nNOS 活性和 NO 生成的影响。5.缺血前给予 nNOS 抑制剂 7-NI，生物素转化法检测 Fas 巯基亚硝基化的变化。.用免疫印迹方法，分别检测缺血再灌过程中 Fas 和 CD95hi 在胞膜和胞浆中 的表达变化，及 GSNO 对其影响。.用免疫沉淀方法，检测 GSNO 对缺血再灌过程中 DISC 和 hiDISC 组装的影响。结果1.大鼠全脑缺血前给予 GSNO 显著减少了再灌注 5d 海马 CA1 区神经元的死亡。2.缺血前给予 GSNO 显著抑制了再灌注 6h 凋亡相关蛋白的活化。3.大鼠全脑缺血再灌注过程中 Fas 巯基亚硝基化增强，再灌注 6h 达高峰；缺 血前给予 GSNO 显著抑制了再灌注 6h Fas 的巯基亚硝基化。GSNO 对照组中 Fas 巯基亚硝基化也有较明显增强，但是远远低于缺血再灌注组。4.缺血再灌 6h nNOS 巯基亚硝基化降低，其