fxr1p蛋白结合结构域鉴定及相关小分子rna筛选-identification of fxr1p protein binding domain and screening of related small molecular rna.docxVIP

主要英文缩略词缩写AD全称AactivationDomain中文名激活域BDBinding Domain结合域AdeAdenine腺嘌呤AmpAmpicilin氨苄青霉素CMAScytidine monophosphate-N-acetylneuraminic acid胞嘧啶核苷酸-N-乙酰神synthetase经氨酸合成酶DMSODimethylformadine二甲基亚砜DODropout supplement省却成分添加剂FBSFetal bovine serum胎牛血清FXR1HisFragileXrelatedgene1Histidine脆性X相关基因1组氨酸kanKanamycin卡那霉素LeuLeucine亮氨酸miRNAODmicroRNAOptical Density小分子RNA光密度PAGEPolyacrylamidegel electrophoresis聚丙酰胺凝胶电泳PCRPolymerase chain reaction聚合酶链式反应PEG4000 RIPSD basePolyethyleneglycol4000RNA-bindingproteinImmunoprecipitation Syntheticdropout minimal base聚乙二醇4000RNA结合蛋白免疫沉淀缺陷型极限培养基TrpTryptophan色氨酸X-gal5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D–Galactopyranoside5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷YNBYeast NitrogenBasewithout amino acids无氨基酸酵母氮源YPDAYPD medium supplemented withAdenine含腺嘌呤YPD 培养基FXR1P蛋白结合结构域的鉴定及相关小分子RNA的筛选中文摘要脆性X 综合征是最常见的遗传性智力低下疾病之一，由FMR1 编码产物FMRP的表达下降或缺失引发疾病。FXR1 与FMR1 有高度的序列及结构相似性，属于脆性X基因家族。FXR1编码产物FXR1P与FMRP在氨基酸序列上具有极高的同源性，属于脆性X蛋白家族。FXR1P是一种对于神经和肌肉系统发育有重要调控作用的蛋白，具有RNA与蛋白质结合功能。FXR1P蛋白及RNAs 结合特性研究在一定程度上有助于了解FXR1P的调节机制及其基本功能，进而明确FXR1P与脆性X 综合征发病机制的关系。目的：1 用FXR1P与CMAS这对经验证有相互作用蛋白质，对FXR1P 分子内的蛋白结合结构域进行鉴定，研究FXR1P的蛋白结合特性，揭示FXR1P 与蛋白质相互作用的分子机制。2对人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞中的FXR1P 与小分子RNA结合情况进行研究，筛选可与FXR1P相互作用的小分子RNAs，鉴定其种类，探索FXR1P与小分子RNAs之间的关系，揭示FXR1P调节目标mRNA的分子机制。方法：1 利用蛋白质结构域在线分析工具PDB数据库，对FXR1P分子进行分析，预测FXR1P的蛋白结合结构域，设计引物扩增可表达包含不同结构域FXR1P分子的基因，产物构建到pGBKT7载体，酵母双杂交鉴定表达产物与CMAS 的相互作用情况，确定相互作用的关键区域。2 利用RNA结合蛋白免疫沉淀技术，在人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞中筛选与FXR1P有相互作用的小分子RNAs，3和5端加特定接头后逆转录为cDNA单链，设计引物进行PCR扩增，回收PCR产物后连接至T载体，转化大肠杆菌DH5α，挑取阳性克隆测序，生物信息学分析确定小分子RNA种类。结果：1成功构建了pGBKT7-FXR1Δ402和pGBKT7-FXR1Δ450 两种表达不同N端FXR1P的重组质粒，经检测无自激活性；酵母双杂交结果显示，FXR1P N端第134–150 之间的17 个氨基酸残基是与CMAS 相互作用的关键区域；2 利用RNA结合蛋白免疫沉淀技术，从SH-SY5Y细胞中筛选得到一种可结合FXR1P大小为23nt 的小分子RNA，将其命名为small RNA-X。结论：1 FXR1P的N端第134–150之间17个氨基酸残基是其蛋白结合的关键区域；2 RIP技术从SH-SY5Y细胞中筛选得到可结合于FXR1P的新小分子RNA，并将其命名为small RNA-X。关键词：FXR1P；蛋白结合结构域；RIP；小分子RNAIdentificationofProtein-bindingDomainofFXR1PandScreeningofAssociatedSmallRNAAbstractFXSisoneofthemostcommonformofinheritedcognitiveimpairment,causedby thed