《生物化学精品教学-广西医科》DNA重组及重组DNA技术-2015-1-4.pptVIP

* * * * * * * * 左下角处有超级链接到配伍末端 * * * * * * * * * * * * 由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切除产生粘性末端，而进行粘端连接。 人工接头(linker)连接 通过其他措施产生黏端进行连接 人工接头及其应用 CCGAATTCG GGCTTAAGC 5′- 3′- Eco RⅠ Eco RⅠ Eco RⅠ Eco RⅠ 在末端转移酶(terminal transferase) 的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。 同聚物加尾连接 5′ 3′ 3′ 5′ 载体DNA 5′ 3′ 3′ 5′ 目的基因 限制酶或机械剪切 限制酶 5′ 3′ 3′ 5′ 5′ 3′ T(T)nT T(T)nT 3′ 5′ 5′ 3′ 3′ 5′ 3′ A(A)nA A(A)nA 3′ 5′ λ-核酸外切酶 λ-核酸外切酶 末端转移酶 + dATP 末端转移酶 + dTTP T(T)nT A(A)nA A(A)nA T(T)nT T4 DNA连接酶 15oC 重组体 5′ PCR法 针对目的DNA的5?-和3?-端，设计一对特异引物，在每条引物的5?-端分别加上不同的RE位点，然后以目的DNA为模板，经PCR 扩增便可得到带有引物序列的目的DNA，再用相应RE切割PCR产物，产生黏端，随后便可与带有相同黏端的线性化载体进行有效连接。 平端连接 限制性内切酶切割产生的平端 粘端补齐或切平形成的平端 适用于： 目的基因 载体 限制性内切酶 限制性内切酶 T4 DNA连接酶 15oC 重组体 载体自连 目的基因 自连 避免载体质粒的自环化 对载体去磷酸化，也就是用碱性磷酸酶处理。 插入片段两边要有磷酸基团，否则是连不上的。 3. 粘-平末端连接 黏-平末端连接是指目的DNA和载体之间通过一端为黏端、另一端为平端的方式进行连接。 属于定向克隆 受体菌条件： 安全宿主菌 限制酶和重组酶缺陷 处于感受态(competent) 导入方式： 转化 (transformation) 转染 (transfection) 感染 (infection) （四）重组DNA转入受体细胞——转 1. 借助载体上的遗传标志进行筛选 (1) 利用抗生素抗性标志筛选 (2) 利用基因的插入失活/插入表达 特性筛选 (3) 利用标志补救筛选 (4)利用噬菌体的包装特性进行筛选 （五）重组体的筛选与鉴定——筛 2. 序列特异性筛选 (1) RE酶切法 (2) PCR法 (3) 核酸杂交法 (4) DNA测序法 3. 亲和筛选法 插入失活筛选带有重组载体的克隆 α互补筛选（蓝-白筛选） 菌落或噬斑原位杂交筛选重组体 重组DNA技术操作过程可形象归纳为： 小结 分 分离获取目的基因 选 载体的选择与构建 接 目的DNA与载体连接 转 重组DNA转入受体细胞 筛 重组体的筛选与鉴定 重组DNA技术操作的主要步骤 载体 质粒 噬菌体 病毒 目的基因（外源基因） 基因组DNA cDNA 人工合成 PCR产物 限制酶消化 开环载体DNA 目的基因 连接酶 重组体 转化 体外包装，转染 带重组体的宿主 筛选 表型筛选 酶切电泳鉴定 菌落原位杂交 表达体系的建立： 表达载体的构建 受体细胞的建立 表达产物的分离纯化 （六）克隆基因的表达 标准：选择标志 强启动子 翻译调控序列 多接头克隆位点 E.coli表达体系的不足： 不宜表达真核基因组DNA； 不能加工表达的真核蛋白质； 表达的蛋白质常形成不溶性包涵体(inclusion body) ； 很难表达大量可溶性蛋白。 1. 原核表达体系 (E.coli表达体系最为常用) 优点：可表达克隆的cDNA及真核基因组DNA 可适当修饰表达的蛋白质 表达产物分区域积累 缺点：操作技术难、费时、经济 转染 —— 将表达载体导入真核细胞的过程 方法：磷酸钙转染 DEAE葡聚糖介导转染 电穿孔 脂质体转染 显微注射 2.真核表达体系（酵母、昆虫、乳类动物细胞） 下图为某种质粒表达载体简图，小箭头所指分别为限制性内切酶EcoRⅠ、BamHⅠ的酶切位点，ampR为青霉素抗性基因。tetR为四环素抗性基因，P为启动子，T为终止子，ori为复制原点。已知目的基因的两端分别有包括EcoRⅠ、BamHⅠ在内的多种