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琼脂糖凝胶电泳实验原理琼脂糖凝胶电泳常用于分离、鉴定 DNA、RNA 分子混合物，以琼脂凝胶作为支持物，利用 DNA 分子在电场中时的电荷效应和分子筛效应，达到分离混合物的目的。DNA 分子在高于其等电点的溶液中带负电，在电场中由阴极向阳极运动。在一定的电场强度下，忽略DNA分子携带的电荷，DNA 分子的迁移速度取决于分子筛效应，即分子本身的大小和构型是主要的影响因素。DNA 分子的迁移速度与相对分子量成反比。不同构型的 DNA 分子的迁移速度不同。如环形 DNA 分子样品，其中有三种构型的分子：超螺旋分子（cccDNA）、开环分子(ocDNA)、和线形 DNA 分子(IDNA)。这三种不同构型分子进行电泳时的迁移速度大小顺序为:cccDNA＞IDNA＞ocDNA。核酸电泳通常使用琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶两种介质。琼脂糖是一种聚合链线性分子；聚丙烯酰胺凝胶由丙烯酰胺（Acr）在 N,N,N′-四甲基乙二胺（TEMED）和过硫酸铵（AP）的催化下聚合形成长链，并通过交联剂 N,N′-亚甲双丙烯酰胺（Bis）交叉连接而成。琼脂糖凝胶适合分离200bp至近50kb的DNA片段，而聚丙烯酰胺凝胶对于小片段（5bp-500bp）的分离效果最好，且分辩力极高。选择不同浓度的凝胶，可以分离丌同大小范围的 DNA 分子。电场强度愈大，带电颗粒的运动赹快。但凝胶的有效分离范围随着电压增大而减小，所以电泳时一般采用低电压，不超过 6V/cm。而对于大片段电泳，可以选择 0.5-1.0V/cm 电泳过夜。如果选择高电压电泳，可使用聚丙烯酰胺凝胶。核酸电泳常采用 TAE、TBE、TPE 三种缓冲系统。TAE 价格低廉，但缓冲能力低。TPE 在进行 DNA 回收时，会使 DNA 污染磷酸盐，影响后续反应。所以综合考虑，多采用 TBE 缓冲液。核酸电泳中常用的染色剂是溴化乙锭（EB）。溴化乙锭是一种扁平分子，可以嵌入核酸双链的配对碱基之间。在紫外线照射 BE-DNA 复合物时，通过发光指示核酸的位置。由于EB有较强的挥发性和毒性，现在大多选择EB替代品进行试验，比较常用的有gelred，goldview，ybr-green等，但是整体效果都若于传统的EB。材料、试剂及器具1、材料合适的Marker（分子量标准）；DNA 样品2、试剂加样缓冲液（6x或10x）；琼脂糖；溴化乙锭（EB）。3、器具（1）电泳系统：电泳仪、水平电泳槽、制胶板等。（2）凝胶成像系统或紫外透射仪。实验过程1、按所分离的 DNA 分子的大小范围，选择合适的比例的凝胶，称取适量的琼脂粉，放到一锥形瓶中，加入适量的 TBE电泳缓冲液。然后置微波炉加热至琼脂粉完全溶化，溶液透明。稍摇匀，得胶液。待胶液却至 60℃左右，在胶液内加入适量的比例的溴化乙锭液。2、水平放置胶槽，在一端插好梳子，在槽内缓慢倒入已况至 60℃左右的胶液，使之形成均匀水平的胶面。3、待胶凝固后，小心拔起梳子，使加样孔端置阴极段放进电泳槽内。4、在槽内加入TBE电泳缓冲液，至液面覆盖过胶面。5、把待检样品，按合适比例与加样缓冲液混匀，用移液枪加至凝胶的加样孔中。6、接通电泳仪和电泳槽，并接通电源，调节合适电压，稳压输出，开始电泳。7、观察溴酚兰的带（蓝色）的位置。当其移动至约凝胶长2/3处时，可停止电泳。8、在紫外透视仪的样品台上重新铺上一张保鲜膜，赶去气泡平铺，然后把凝胶放在上面。关上样品室外门，打开紫外灯（360nm 或 254nm），通过观察孔进行观察。注意事项1、电泳中使用的溴化乙锭（EB）为中度毒性、强致癌性物质，务必小心，勿沾染于衣物、皮肤、眼睛、口鼻等。所有操作均只能在专门电泳区域操作，戴一次性手套，并及时更换。2、预先加入EB 时可能使 DNA 的运动速度下降15%左右，且不同构型的 DNA 的影响程度不同。所以为取得较真实的电泳结果可以在电泳结束后再用 0.5μg/ml 的 EB 溶液浸泡染色。EB在光照下易降解，若凝胶放置一段时间后才观察，即使原来胶内或样品已加 EB，建议选择EB溶液浸泡染色。3、加样进胶时不要形成气泡，需在凝胶液未凝固之前及时清除，否则，需重新制胶。4、电泳时溴酚兰在琼脂糖凝胶中的运动速度可以用于参考电泳速度，已实际电泳条带运动速度为准。常见问题分析常见问题原因对策DNA条带模糊DNA降解实验过程避免核酸酶污染电泳缓冲液陈旧电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低，PH值上升，缓冲能力减弱，从而影响电泳效果。TBE建议使用10次就更换缓冲液所用电泳条件不合适电泳时电压不应超过6V/CM，温度＜30℃，巨大DNA链电泳，温度应＜15℃，核查所用电泳缓冲液的缓冲能力，注意经常更换DNA上样量过多减少凝胶中DNA上样量DNA含盐过高电泳前通过乙醇沉淀去除多余盐分有蛋白污染电泳前酚抽提去除蛋白