一种基于公共引物介导的白血病分子诊断技术分析-analysis of leukemia molecular diagnosis technology based on common primers.docxVIP

一种基于公共引物介导的白血病分子诊断技术研究中文摘要 一种基于公共引物介导的白血病分子诊断技术研究 中文摘要 I I PAGE IV PAGE IV 一种基于公共引物介导的白血病分子诊断技术研究 中文摘要 目的：本课题利用公共引物介导的多重 RT-PCR 技术，以常见的白血病融合基因 作为检测靶标，目的在于研究建立新型的、系统的、提高 PCR 检测通量的方法体系， 研发适用于临床的常见白血病融合基因检测试剂盒。 方法：本课题包括设计公共引物的设计与鉴定、重叠延伸法构建质粒模板、多重 检测体系的建立和临床样本检测。（1）用 Primer Premier5.0 软件以非人基因组为模 板进行基础公共引物的设计；采用 NCBI 网站 Primer-blast 功能进行公共引物与人基 因组、人 cDNA 的特异性的理论比对；理论设计和筛选的公共引物分别与人基因组和 人 cDNA 进行特异性温度梯度 PCR 实验验证；将实验验证后的公共引物序列连接到 人类一段 GAPDH 基因的两端，插入到载体中构建质粒，利用含公共引物的质粒模板 检测公共引物扩增的敏感性；（2）文献检索和数据库筛选本课题多重体系的白血病 融合基因检测靶标；通过重叠延伸法将位于人 cDNA 上不同位置的两个基因片段通过 PCR 技术扩增获得后连接在一起，插入载体构建包含检测靶标融合基因的突变型质 粒模板：BCR/ABL e1a2 型和 e13a2 型、PML/RARα L 型和 S 型、E2A/PBX1 I 型、 AML1/ETO、 E2A/HLF 、 TEL/AML1 、 TEL/ABL 和 CBFβ/MYH11 A 型 ， 另 有 一 包 含 SIL/TAL1 型融合基因的质粒模板通过直接合成法获得；（3）利用 Primer Premier5.0 设计检测靶标基因特异性引物，将公共引物连接在靶标特异引物的 5’末端构成嵌合引 物，利用 NCBI 网站 Primer-blast 功能进行嵌合引物的比对、修改和筛选，同时利用 MFE2.0 软件进行体系多重引物的比对和修改；本课题针对常见的白血病融合基因设 计了 2 个多重检测体系，体系 1 针对 BCR/ABL、AML1/ETO、PML/RARα和 E2A/PBX1 融合基因型；体系 2 在体系 1 基础上添加检测靶标 E2A/HLF、TEL/AML1、TEL/ABL、 CBFβ/MYH11 和 SIL/TAL1；通过构建的包含白血病融合基因的突变型质粒模板进行体 系特异性和敏感性检测。将 PCR 扩增得到的产物用琼脂糖凝胶电泳检测后通过紫外 凝胶成像系统分析结果，进行多重体系的构建和优化；（4）收集正常人及白血病患 者的外周血，根据 TRIzol 一步抽提法获得人 total RNA，6 随机引物和 MMLV 逆转录 酶进行逆转录反应获得 cDNA；采用本课题构建的多重体系进行临床标本的检测，同 时对比临床检测结果分析和评价公共引物介导的多重 RT-PCR 体系。 结果：本课题成功建立了筛选公共引物的方法体系；设计了三对公共引物，通过 与人基因组、人 cDNA 的理论和 PCR 实验比对，结果均无产物；其中一对公共引物 与包含公共引物序列的质粒载体进行敏感性 PCR 检测时，检测结果可达 100 个拷贝， 选取该公共引物用于课题后期构建多重检测体系。采用重叠延伸技术成功构建了十个 包含白血病融合基因的突变型质粒模板；本课题设计的两个针对常见白血病融合基因 的多重检测体系均可特异、敏感地检测白血病融合基因。体系 1 可有效检测针对 BCR/ABL、AML1/ETO、PML/RARα和 E2A/PBX1 这 4 种融合基因的 6 个突变型质粒模 板，即 BCR/ABL e1a2 型、PML/RARα S 型、E2A/PBX1 I 型、BCR/ABL e13a2 型、 PML/RARα L 型和 AML1/ETO 型，其敏感性检测结果依次为 103，102，102，10，103 和 102 拷贝。体系 2 针对 BCR/ABL、AML1/ETO、PML/RARα、E2A/PBX1、E2A/HLF、 TEL/AML1、TEL/ABL、CBFβ/MYH11 和 SIL/TAL1 这 9 种融合基因的 11 个突变型检测 模板，即 BCR/ABL e13a2 型、TEL/AML1 型、BCR/ABLe1a2 型、PML/RARα 的 L 型、 PML/RARα S 型、AML1/ETO、E2A/PBX1 I 型、E2A/HLF 型、TEL/ABL 型、CBFβ/MYH11 A 型和 SIL/TAL1 型，其敏感性检测结果依次为：102，102，103，103，103，103，103， 103，103，104，104 拷贝。运用