新型载体材料固定化酶的制备 性能和应用分析-preparation performance and application analysis of new carrier material immobilized enzyme.docx

为载体实现漆酶的同步包封固定化，并将其应用于非水有机介质中的催化和实现酶在有机溶介质中的循环利用。经疏水改性的纳米SiO2粒子（SiO2NPs）自组装吸附排列在含漆酶的缓冲溶液和甲苯的两相界面，并形成稳定的W/O的Pickering乳液后，加入具有一定亲水性的超支化硅烷（PEOS），当PEOS到达两相界面遇酸性水溶液立即水解，在自身缩聚的同时与SiO2NPs上的残键缩聚，将SiO2NPs固定于W/O两相界面，从而制备出在有机溶剂中具有良好分散性的全硅胶体体中空微球包封固定漆酶。该方法制备的水芯全硅胶体体载体包封固定漆酶理论包封率高；调整二氧化硅纳米粒子（SiO2NPs）与水的质量比（Rs/w）可控制胶体体中空微球的壳壁结构和粒径尺寸，当Rs/w分别为0.2、0.3和0.4时，对应胶体体中空微球壳壁从单层SiO2NPs壳壁至双层SiO2NPs壳壁，粒径分别为1.39±0.22μm、0.99±0.17μm和0.75±0.12μm；全硅胶体体包封固定漆酶在有机介质中的活性和循环利用性能与制备参数Rs/w有关，即与壳壁结构有关，随Rs/w（0.2、0.3和0.4）的增加，胶体体中空微球壳壁结构越致密、越厚（单层SiO2NPs壳壁至双层SiO2NPs壳壁），从而抑制内外物质交换导致其在非水有机介质中催化活性越低，但其力学性能越来越稳定，保障其在多次循环利用后仍保持较高催化能力：其在非水有机介质中催化活性分别为131.08μmol/h、107.75μmol/h和14.40μmol/h，经6次循环使用后，对应残留活性分别约为30%，60%和70%。II（2）两亲性前驱体聚合物自模板法成功实现了水相中制备介孔硅质中空微球同步包封固定蛋白酶。以聚乙二醇单甲基醚（PEG）改性超支化硅烷（PEOS）获得两亲性PEG-PEOS自模板聚合物；连续搅拌含蛋白酶和PEG-PEOS的水溶液，两亲性PEG-PEOS自组装形成合围蛋白酶分子的中空囊泡，在碱性条件下该PEG-PEOS囊泡水解缩聚，从而获得可同步固定蛋白酶的介孔硅质中空微球。该包封固定蛋白酶的介孔硅质中空微球平均水合粒径为232.7nm，壳壁厚度为15.0~40.0nm且壳壁具有~3.8nm的介孔；该介孔硅质中空微球同步固定蛋白酶的包封率约为50%，比活性~55U/mg；由于胶囊壳壁的保护作用，其固蛋白酶的热稳定性和pH稳定性得到提高：80℃条件下保温1h后其活性仍保留~80%，不同pH值条件孵化后残留酶活差异不到10%；并且显著提高在离液剂表面活性剂（SDS）中的稳定性，其在不同浓度SDS溶液（0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%和3.0%）中孵化30min后残留活性分别为84.0%、58.7%、56.0%、52.1%、44.4%和46.3%，远远高于对应浓度下游离蛋白酶的残留活性（＜20%）；同时，该介孔硅质中空微球固定蛋白酶经8次循环使用后，其活性仍保持50%以上，具有良好循环利用性能。（3）利用反相微乳液法在室温条件下制备智能凝胶粒子P(NIPAAm-co-AAc)，并在制备过程中加入EDC活化羧基，从而一步实现P(NIPAAm-co-AAc)共价固定漆酶。研究发现，共聚单体摩尔比和反应体系内漆酶的加入会影响形成的P（NIPAAm-co-AAc）凝胶粒III子的形貌特征和响应性能；固定酶的P(NIPAAm-co-AAc)凝胶的VPTT向高温偏移，约为34℃，并且pH响应性变弱；P(NIPAAm-co-AAc)凝胶粒子共价固定漆酶与包埋固定漆酶相比，有效的抑制了固定酶的逸出问题，在多次离心、洗涤处理后，共价交联固定漆酶的含酶量较凝胶包封固定漆酶的含酶量高~20%；该凝胶粒子共价固定漆酶的活性随共聚单体AAc量的增加（NIPAAm:AAc=100:2、100:4和100:6)而增加，其比活性分别为49.6U/mg，65.7U/mg和125.5U/mg；P(NIPAAm-co-AAc)凝胶粒子共价固定漆酶有效提高了酶的稳定性：P(NIPAAm-co-AAc)固定漆酶在50℃保温1h后，残留活性~90%，而游离漆酶的残留活性约为65%；60℃保温1h后，游离漆酶的残留活性约仅为37%，而应固定化漆酶的残留活性却高达~80%；70℃保温1h后，固定化漆酶残留活性高于游离漆酶残留活性＞20%；与此同时，凝胶固定漆酶的pH稳定性也得到显著提高，并且经6次循环使用后其残留活性仍为~45%；研究发现，P(NIPAAm-co-AAc)凝胶本身虽具有吸附染料的能力，可在一定程度上实现对染液的脱色，但效果并不理想，其脱色率约为30%，而P(NIPAAm-co-AAc)凝胶固定漆酶脱色率可达~60%，并且P(NIPAAm-co-AAc)凝胶固定漆酶在多次循环脱色使用后，仍具有良好的脱色效果。（4）研究以p