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雷公藤内酯醇靶蛋白筛选及其结合初步验证 　　摘 要 采用噬菌体展示肽库技术筛选雷公藤内酯醇的靶蛋白，得到了一个肽段，并通过酶联免疫吸附（ELISA）和免疫共沉淀验证了该片段对雷公藤内酯醇的结合特异性。用Basic Local Alignment Search Tool （BLAST）进行序列对比后，找到了77个匹配序列，其中最为匹配的序列是人类类固醇生成因子-1（hSF-1），因此hSF-1可能是雷公藤内酯醇的一个潜在受体。在大肠杆菌中表达纯化了hSF-1的配体结合域（LBD），荧光光谱实验表明雷公藤内酯醇对hSF-1-LBD有荧光淬灭作用、等温滴定量热（ITC）实验表明雷公藤内酯醇与hSF-1-LBD发生焓驱动的特异性结合，表面等离子体共振（SPR）实验表明雷公藤内酯醇可以与hSF-1-LBD剂量依赖性结合, 这些都证实了hSF-1与雷公藤内酯醇存在特异性相互作用。 　　关键词 雷公藤内酯醇；类固醇生成因子-1；噬菌体随机肽库；荧光光谱；等温滴定量热 　　 2011-05-16??稿；2011-09-30接受 　　本文系国家自然科学基金支持（N 　　*E-mail: wjzheng@nju.省略 　　1 引 言 　　雷公藤内酯醇是从中草药雷公藤（Tripterygium wilfordii Hook F.）根中提取的一种二萜内酯活性化合物。雷公藤用于治疗类风湿性关节炎、发烧、水肿以及各种痈肿（carbuncles）[1]。美国国家卫生研究院资助的一项临床试验证实，雷公藤对于治疗类风湿性关节炎具有显著疗效[2,3]。雷公藤内酯醇具有多种生物活性，包括强力的抗炎及免疫抑制活性，有效的抗增殖及其抗癌作用等[4,5]。陆静等[6]采用高效液相色谱发分离雷公藤内酯醇的相关衍生物，探索了该药物的稳定性和可能的降解机理。有研究表明，雷公藤内酯醇可以诱导细胞凋亡，但具体是通过膜受体途径还是线粒体途径起作用[7～9]以及雷公藤内酯醇诱导细胞凋亡是否依赖于p53都尚有争议[10,11]。目前对雷公藤内酯醇作用机理的研究主要集中在雷公藤内酯醇的作用结果上，缺少对雷公藤内酯醇靶蛋白的确定和作用途径等核心问题的研究[12]。虽然Leuenroth等曾找到一些雷公藤内酯醇可能的结合蛋白，但是尚缺乏直接的结合数据和深入的研究[13～15]。以往的研究显示，雷公藤内酯醇对多种生物学途径、多种生物分子都有影响，因此雷公藤内酯醇可能存在多个作用靶点，筛选雷公藤内酯醇的靶蛋白，对深入了解其作用机制、阐明其作用途径，是十分必要的。 　　雷公藤内酯醇很难被直接标记和检测，迄今没有雷公藤内酯醇的特异性抗体，而用[.3H]标记雷公藤内酯醇又非常复杂[13]。噬菌体肽库展示技术是筛选生物分子多肽配体的一种有用工具，已经成功用于筛选小分子化合物、蛋白质甚至细胞的多肽配体[16～18]，因此用噬菌体肽库展示技术筛选雷公藤内酯醇的多肽配体确定其可能的靶蛋白，可能是一种有效的途径。 　　雷公藤内酯醇不含游离氨基或羧基，不能直接包被到多孔板上。用琥珀酸酐修饰雷公藤内酯醇，并将它与卵清蛋白偶联，命名为Tri-OVA[19]。由于增加了游离的羧基，Tri-OVA可以很容易地包被到多孔板上，成为雷公藤内酯醇配体筛选及检测的理想的起始材料。本研究采用两种噬菌体展示肽库（线性?7肽库和环7肽库）筛选雷公藤内酯醇多肽配体，最终从环7肽库中富集到一组七肽序列。ELISA和免疫沉淀检测均证明，出现频率最高的七肽序列的噬菌体克隆（C7C-1）与雷公藤内酯醇亲和力最高。用Basic Local Alignment Search Tool （BLAST）进行序列比对后，确定其中得分较高的人类固醇生成因子1（Human steroidogenic factor-1，hSF-1）为雷公藤内酯醇可能的靶蛋白之一。在大肠杆菌中表达并纯化了hSF-1的配体结合结构域（LBD），通过荧光光谱实验、等温滴定量热（ITC）实验和表面等离子体共振（SPR）实验验证了hSF-1与雷公藤内酯醇的特异性结合，证明雷公藤内酯醇在体外可以与hSF-1特异性结合，但这种结合较弱。鉴于雷公藤内酯醇生物学效应的多样性和广泛性，推测雷公藤内酯醇可能存在多个生物学靶点和其它特异性受体，需要进一步的筛选和研究。2 实验部分 　　2.1 肽库及宿主菌 　　噬菌体随机环7肽库（Ph.D.-C7C， 美国New England BioLabs公司）由南京大学沈萍萍馈赠。肽库利用大肠杆菌丝状噬菌体M13构建，随机肽库融合在次要衣壳蛋白pⅢ的N端，在大肠杆菌ER2738菌株中维持和扩增。噬菌体的多样性为1.2×10.9个转化子，滴度为2×1011 pfu/ 　　?SymbolmA@ L，滴度测定按照说明书操