水体中大肠菌群的测定课件.pptVIP

【目的要求】 1. 学习和掌握大肠菌群的测定方法（多管发酵法） 2. 了解测定过程中每一步的反应原理。 3. 了解大肠菌群的数量在饮水中的重要性 发酵法： 又称多管发酵法或三步发酵法(此法是根据大肠菌群具有发酵乳糖产酸产气的特性，利用含乳糖的培养基培养不同稀释度的样品经初发酵、平板分离和复发酵3个检测步骤，最后根据结果查最大自然数（most probable number）表，算出食品中的大肠菌群数。 ) 发酵管内装有乳糖蛋白胨液体培养基，并倒置杜氏小套管。乳糖能起选择作用，因为很多细菌不能发酵乳糖，而大肠菌群能发酵乳糖而产酸产气。为便于观察细菌的产酸情况，培养基内加有溴甲酚紫作为pH指示剂，细菌产酸后，培养基即由原来的紫色变为黄色。溴甲酚紫还有抑制其他细菌如芽孢菌生长的作用。 水样接种于发酵管内，37℃下培养： （1）24h内小套管中有气体形成，并且培养基混浊，颜色改变，说明水中存在大肠杆菌，疑为阳性结果； （2）在量少的情况下，也可能延迟48h后才产酸产气，此时应视为可疑结果。 以上两种结果均需继续做下面两部分实验，才能确定是否是大肠菌群。 （3）48h后仍不产气的为阴性结果。 水体中大肠菌群的测定 【课前预习】 　1. 典型的大肠杆菌群菌落特征是什么？ 　2. 食品中大肠菌群数测定的意义是什么？ 【实验原理】 大肠菌群是一群能在37℃培养48h内发酵乳糖产酸、产气的需氧或兼氧革兰氏染色阴性无芽抱杆菌。以大肠杆菌为主，包括肠细菌属、柠檬酸细菌属、埃希氏菌属和克雷伯氏菌属等。 大肠菌群在肠道和粪便中数量非常高，且与肠道和粪便中的病原菌生活习性相近，可作为判断样品是否被人、畜粪便污染的标志。 1) 初发酵（推测试验）： 将不同稀释度的水样，分别接种于含有乳糖等糖 类的培养液中（3倍或1倍乳糖培养基，视所加的水样 体积和培养基体积而定），经37 oC培养24 h，观察产 酸产气情况，以初步判断是否有大肠菌群存在。 2）平皿分离（证实试验） 水中除大肠菌群外，尚有其它细菌可能引起糖类发酵，因此需要进一步证实。 将初发酵管中已发酵的菌液接种于伊红美兰培养基，37 oC培养24 h，根据菌落特征，挑取可能为大肠菌群的菌落制片，经革兰氏染色，进一步证实是否为大肠菌群。 平板培养基使用伊红美蓝琼脂（eosin methyleneblue agar，EMB agar）。伊红美蓝琼脂平板含有伊红和美蓝染料，在此亦作为指示剂，大肠菌群发酵乳糖造成酸性环境时，该两种染料即结合成复合物，使大肠菌群产生带核心的、有金属光泽的深紫色（龙胆紫的紫色）阳性菌落。初发酵管24h内产酸产气和48h产酸产气的均需在以上平板上划线分离菌落。 3） 复发酵试验(完成实验） 将上述可能为大肠菌群的菌落再次转接入1倍乳糖培养液中，经37 oC培养24 h，产酸产气者即最后确证为存在大肠菌群。 产酸、产气分别记为阳性反应，不产酸、产气则记为阴性反应； 根据阳性管数量，查表求得水体大肠菌群的数量。 1. 被检样品　根据不同需要选择检检样品（如自来水、湖水等） 2. 培养基　乳糖胆盐发酵培养基，伊红美蓝固体培养基，乳糖发酵培养基 3. 试剂　革兰氏染色液，芽孢染色液 4. 其它　显微镜，天平，培养箱，水浴锅，研钵，平皿，试管，刻度吸管，涂布器 【实验材料】 【操作步骤】 1．水样的采取（青山湖水，应取距水面10-15cm的深层水样，用灭菌带玻璃塞的瓶子，瓶口向下侵入水中，然后翻转过来，除去玻璃塞，水既流入瓶中，盛满后，将瓶塞盖好，再从水中取出） 2．湖水的检查 （1）初（步）发酵实验 水样的稀释： 10-2、10-3 、10-4 （用无菌水稀释） 接种：取0.5ml上三个稀释度的水样接入装有4.5ml三倍浓缩乳糖蛋白胨发酵管（水样的体积和培养液的体积由试管而定） ，混匀后，37 ℃培养24 h。 （2）平板分离 将经24 h培养后产酸产气的发酵管，分别划线接种于伊红美蓝琼脂平板上，再于37 ℃培养18～24 h，将符合下列特征的菌落进行染色镜检。 深紫黑色，有金属光泽； 紫黑色，不带或略带金属光泽； 淡紫红色，中心颜色较深。 （3）复发酵试验 将镜检为革兰氏阴性无芽孢杆菌的菌株重复初步发酵试验(利用乳糖蛋白胨培养液)。仍为产酸产气者为大肠杆菌阳性。 （4） 结果计算：根据三个稀释度中阳性管数组成一个数量指标，查MPN计数表10-1 10ml×100 1ml×100 1ml×10-1 1ml×10-2 3× 1× 1× 1× 1支 各3支 【