第九章凝胶过滤及离交换析介质.pptVIP

* * * 离子交换剂的处理、再生和转型 1)处理 取适量的固体离子交换剂先用水浸泡，待充分膨胀后即可进行处理。常规的处理步骤是，加过量的水悬浮除去细颗粒，而后改用酸碱浸泡，以便除去杂质并使其带上需要的反离子。在每次用酸(或碱)处理后，均应先用水洗涤至近中性，再用碱(或酸)处理。末了用水洗涤至中性，经缓冲液平衡后即可使用或装柱。 * 2）再生 使用过的离子交换剂，可采用一定的方法令其恢复原来的性状，这一过程叫再生。再生可以通过上述的酸、碱反复处理完成，但有时也可以借助转型处理完成。所谓转型是指离子交换剂由一种反离子转到另一种反离子的过程，转型后的离子交换剂会按使用要求带上一定种类的离子或基团。总之，对离子交换剂的处理、再生和转型的目的是一致的，即要求其带上使用时所期望的离子或基团。 * 3）转型 长期使用的亲水性离子交换剂的处理一般只用酸、碱浸泡即可。原则上讲，去除杂质的过程应在不破坏离子交换剂的结构和稳定性，不影响其原有交换容量的前提下进行。对于琼脂糖离子交换剂的处理是在使前仅用蒸馏水漂洗、缓冲液平衡后即可。其他亲水性离子交换剂的再生和转型操作和琼脂糖离子交换剂的一样。 * 4.离子交换层析的基本操作 （1）层析柱 离子交换层析要根据分离的样品量选择合适的层析柱，离子交换用的层析柱一般粗而短，不宜过长。直径和柱长比一般为1：10～1：50之间，层析柱安装要垂直。装柱时要均匀平整，不能有气泡。 * （2）装柱 先把柱内装满起始缓冲液，用玻璃棒挤压海绵，赶尽气泡并把柱子垂直固定；将交换剂用起始缓冲液调稀搅匀后加入，柱内的交换剂应非常均匀地分布，不应出现节面和气泡，不能干柱，床面要平整，床高距柱顶2～3cm为宜； * （3）平衡缓冲液 平衡缓冲液是指装柱后及上样后用于平衡离子交换柱的缓冲液。平衡缓冲液的离子强度和pH值的选择首先要保证各个待分离物质如蛋白质的稳定。其次是要使各个待分离物质与离子交换剂有适当的结合，并尽量使待分离样品和杂质与离子交换剂的结合有较大的差别。一般是使待分离样品与离子交换剂有较稳定的结合。而尽量使杂质不与离子交换剂结合或结合不稳定。 * （4）上样 离子交换层析的上样时应注意样品液的离子强度和pH值，上样量也不宜过大，一般为柱床体积的1%-5%(体积分数)为宜，以使样品能吸附在层析柱的上层，得到较好的分离效果。将柱中的缓冲液逐渐放出，使顶部液面达到近于柱床面时开始加样。用注射器或细长的玻管沿柱壁绕环加入酶样，待样液达一定高度后再在柱中间小心加样。待样品刚好全部进入床内后用足够量的起始缓冲液流过层析柱，洗出未被吸附的物质。 * （5）洗脱缓冲液 在离子交换层析中一般常用梯度洗脱，通常有改变离子强度和改变pH值两种方式。改变离子强度通常是在洗脱过程中逐步增大离子强度，从而使与离子交换剂结合的各个组分被洗脱下来；而改变pH值的洗脱，对于阳离子交换剂一般是pH值从低到高洗脱，阴离子交换剂一般是 pH 值从高到低。 由于pH值可能对蛋白的稳定性有较大的影响，故一般通常采用改变离子强度的梯度洗脱 * (6) 洗脱速度 洗脱液的流速也会影响离子交换层析分离效果，洗脱速度通常要保持恒定。一般来说洗脱速度慢比快的分辨率要好，但洗脱速度过慢会造成分离时间长、样品扩散、谱峰变宽、分辨率降低等副作用，所以要根据实际情况选择合适的洗脱速度。如果洗脱峰相对集中某个区域造成重叠，则应适当缩小梯度范围或降低洗脱速度来提高分辨率；如果分辨率较好，但洗脱峰过宽，则可适当提高洗脱速度。 * （7）样品的浓缩、脱盐 离子交换层析得到的样品往往盐的质量分数较高，而且体积较大，样品质量分数较低。所以一般离子交换层析得到的样品要进行浓缩、脱盐处理。 * 思考 简述离子交换层析的基本原理? 为达到良好的生化分离目的对离子交换剂的主要指标有什么普遍性要求? 凝胶排阻层析\凝胶渗透层析的概念,分离原理. 凝胶排 阻层析主要特点/优点 凝胶排 阻层析的主要参数 对凝胶排阻流动相的要求.优良的凝胶排阻固定应该具备的特点 凝胶排阻主要填料类型及代表性产品 * 主要的凝胶过滤品种---琼脂糖系 （二）琼脂糖凝胶：　 Sepharose Fast Flow 是经过高度交联的琼脂糖珠体，机械强度大大加强，流速快。 * * 主要的凝胶过滤品种---聚丙烯酰胺系 （三）聚丙烯酰胺凝胶：　　是一种人工合成凝胶，是以丙烯酰胺为单位， 由甲叉双丙烯酰胺交联成的，经干燥粉碎或加工成形制成粒状，控制交联剂的用量可制成各种型号的凝胶。交联剂越多，孔隙越小。聚丙烯酰胺凝胶的商品为生物胶－P （Bi