实验五 DNS法分析蛋白质N-末端4.pptVIP

DNS法分析蛋白质N-末端氨基酸 标准氨基酸和所分析蛋白质的DNS化 DNS蛋白质的酸水解（水解管封管、温度等） 聚酰胺薄膜层析（展层剂的选择和配制、毛细管点样、展层装置） 紫外灯下的观察 蛋白质结构分析有关方法 蛋白质要求很纯 一级结构分析（氨基酸序列分析）：N、C-末端的测定判断肽链数；拆分肽链；各肽链氨基酸序列分析；二硫键位置的确定。 立体结构分析：各种光谱分析；X-光衍射分析；质谱及核磁共振等分析。 有关资料 序列测定（sequencing）已有50多年的历史，但开始时进展 十分缓慢。最初，人们致力于建立蛋白质和多肽的分离技 术，并确定其氨基酸种类及含量。1945以前，没有任何蛋白 质序列定量测定的方法。以后十年中，由于色谱技术和标记 方法的快速进展，第一个多肽激素（胰岛素）的全序列测定 于1955年完成（Ryle等，1955）。五年后，第一个酶（核 糖核酸酶）序列测定完成（Hirs等，1960年）。1965年，约 有20个含100多个残基的蛋白质序列被确定。截止1980年， 这一数字已达1500个。而今天，已测定的蛋白质序列已达30 万个，这在50年前是难以想象的。 最初，蛋白质序列测定主要采用手工的埃德曼降解和环甲基 化（Edman deglation - dansylation）方法（Edman，1950 年）。蛋白质序列测定的快速进展，应该归功于自动测序仪 的研制成功。与埃德曼和贝格于1967年发明的测序法相比， 1980年开始使用的自动测序仪的灵敏度提高了近1万倍。 质谱技术的发展为蛋白质序列测定开辟了新的途径。第一次 用这种方法测定完整的蛋白质分子是在1997年。质谱法测序 的突出优点是可以识别翻译后修饰而得到的特殊氨基酸。用 其它方法进行蛋白质序列测定时，这种修饰信息无法获得。 正是利用了质谱技术，人们得出了r-氨基丁酸处于凝血素N- 末端的重要结论。 DNS法分析蛋白质N-末端氨基酸的原理 蛋白质的α-氨基与丹磺酰氯（DNS-Cl是一种荧光物质）在碱性条件下反应，生成DNS-蛋白质，经酸水解可生成DNS-氨基酸。通过聚酰胺薄膜层析分析DNS-氨基酸，可确定蛋白质的N-末端氨基酸。此法灵敏度高，也可用于蛋白质的氨基酸组成的测定。 1、α-氨基与丹磺酰氯的反应 2、 DNS-蛋白质的酸水解 1、DNS—氨基酸衍生物在6mol/L盐酸中105℃水解22小时，除DNS—色氨酸全部被破坏，DNS-脯氨酸(77％)，丝氨酸(35％)，甘氨酸(18％)，丙氨酸(7％)部分被破坏外，其余DNS—氨基酸很少破坏。 2、DNS—C1与蛋白质的侧链基团巯基、咪唑基、ε-氨基和酚羟基反应，前两者在酸碱条件下均不稳定，酸水解时完全破坏；DNS-ε-赖氨酸和DNS-O酪氨酸较稳定，同时还有DNS-双-赖氨酸和DNS-双-酪氨酸生成，层析后在层析图谱的位点上，都与DNS-α-氨基酸有区别。 3、DNS-C1在pH过高时，水解产生副产物DNS-OH，在DNS-C1过量时，会产生DNS—NH2，DNS-氨基酸在紫外光照射下呈现黄色荧光，而DNS-OH和DNS-NH2产生蓝色荧光，可彼此区分开。 3、乙酸乙酯抽提 DNS-氨基酸在酸性条件下(pH2～3)一般都可被乙酸乙酯抽提，然后取乙酸乙酯层点样层析，这样大量DNS-C1的反应副产物DNS-OH可留于水相，干扰因素减少，所得层析图谱清晰。但若是DNS-精氨酸，DNS-天冬氨酸，DNS-谷氨酸，DNS-苏氨酸，DNS-丝氨酸则它们大部分或部分留于水相，往往会被遗漏，而导致错误结论。这时可将样品浓缩干，用甲醇直接溶解后点样，由于上述DNS-氨基酸的层析位置都位于DNS-OH的下侧，影响不大，这一点在测定多肽或蛋白质的N末端时要特别注意。 4、聚酰胺薄膜层析 1、DNS-氨基酸可用聚酰胺薄膜层析法进行分离和鉴定，在薄膜上检测灵敏度为0．01μg(相当于10—10mol)。聚酰胺薄膜层析是1966年后发展起来的一种新层析技术。由于它具有灵敏度高，分辨力强，快速，操作方便等优点，已被广泛应用于各种化合物的分析。 2、聚酰胺是—类化学纤维原料，即锦纶(又称尼龙)，对极性物质的吸附作用是由于它能和被分离物之间形成氢键。这种氢键的强弱就决定了被分离物与聚酰胺薄膜之间吸附能力的大小。层析时，展层剂与被分离物在聚酰胺膜表面竞争形成氢键。因此选择适当的展层剂使分离在聚酰胺膜表面发生吸附、解吸附、再吸附、再解吸附的连续过程，就能达到分离物分离的目的。 3、聚酰胺薄膜是在涤纶片基上涂上一层锦纶薄膜制成的。 实验方法 聚酰胺薄膜层析 点样 层析