Sanger双脱氧链终止法.ppt

Sanger双脱氧链终止法 ——DNA测序的基本方法 基本原理： * * 核苷酸的连接方式：磷酸二酯键 将2’ ，3’ –双脱氧核苷酸（ddNTP） 参入到新合成的DNA链中，由于参入的ddNTP缺乏3’ –羟基，因此不能与下一位核苷酸反应形成磷酸二酯键，DNA合成反应将中止。 通常DNA的复制需要：DNA聚合酶，纯单链DNA模板，带有3‘-OH末端的单链寡核苷酸引物，4种dNTP（dATP、dGTP、dTTP和dCTP）， ddNTP 。 单链DNA可以由双链DNA完全变性而得到。 其方法，简单的来说， 将反应体系加热至95℃即可得到。 所需模板及其获得方法： dATP为三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸，生物用dNTP来合成DNA 。 ddATP为三磷酸腺嘌呤双脱氧核苷酸，核糖2号3号C上羟基的O被脱去，由于它掺入DNA后DNA的合成就终止了，所以ddNTP是用来测序的。  dATP与ddATP的区别： DNA聚合酶的特点： 其耐热性极强, 在 95 ℃ 40 min, 仍具有 很强的聚合活性; 利用重组酶在常规PCR 条件下, 成功扩增了5.3 kb的拟南芥Timeless 基因片段.  可以购买通用引物或实验室合成15bp ～ 26bp长度的引物，通常以2μg/ml的浓度贮存于-20℃ 备用。 关于引物： Sanger双脱氧链终止法的具体操作： 测序时分成四个反应, 每个反应除上述成分外分 别加入2,3-双脱氧的A, C, G, T核苷三磷酸 (称为ddATP, ddCTP,ddGTP, ddTTP), 然后进行 聚合反应. 在第一个反应物中, ddATP会随机地代 替dATP参加反应一旦ddATP加入了新合成的DNA 链, 由于其3位的羟基变成了氢, 所以不能继续延伸. 所以第一个反应中所产生的DNA链都是到A就终止 了; 同理第二个反应产生的都是以C结尾的; 第三个反 应的都以G结尾, 第四个反应的都以T结尾, 电泳后就 可以读出序列了. 假如有一个DNA, 互补序列是GATCCGAT, 我们试着做一下: 在第一个反应中由于含有dNTP+ddATP, 所以遇到G, T, C三个碱基时没什么问题, 但遇到A时, 掺入的可能是dATP或ddATP, 比如已合成到G, 下一个如果参与反应的是ddATP则终止, 产生一个仅有2个核苷酸的序列: GA, 否则继续延伸, 可以产生序列GATCCG, 又到了下一个A了. 同样有两种情况, 如果是ddATP掺入, 则产生的序列是GATCCGA, 延伸终止, 否则可以继续延伸, 产生GATCCGAT. 将得到如下结果： 1 产生的都是以A结尾的片段: GA,GATCCGA。 2 3 4 产生的都是以C结尾的片段: GATC, GATCC 产生的都是以G结尾的片段: G, GATCCG 产生的都是以T结尾的片段: GAT, GATCCGAT 制得的四组混合物全部平行地点加在变性聚丙烯酸受凝胶电泳板上进行电泳，每组制品中的各个组分将按其链长的不同得到分离，从而制得相应的放射性自显影图谱。从所得图谱即可直接读得DNA的碱基序列。  即可得到测序结果：为GATCCGAT *