(免疫检测技术知识）第5章 胶体金课件.pptVIP

柠檬酸三钠与胶体金颗粒直径的关系0.01%HAucl4 1％柠檬酸三钠(ml) 直径(nm) 100 5.0 10.0 100 4.0 15.0 100 1.5 25.0 100 1.0 50.0 100 0.75 60.0 100 0.60 70.0 100 0.42 98.0 100 0.32 147.0 100 0.25 160 (3)鞣酸---柠檬酸三钠还原法(slot 1985) A液：1％氯化金 1ml 蒸馏水 79ml B液：1％柠檬酸三钠 4ml 1％鞣酸 0.1ml 25mmol/L K2CO3 0.1ml 蒸馏水 15.8ml 将上述A液加温到60℃，然后将B液快速加入到A液中，在10min内煮沸，此时颜色由黑→蓝→亮红。 鞣酸---柠檬酸三钠还原法 B液 A液直径(nm) 1％柠檬酸钠 0.1M 2%鞣酸 H2O2 1％ H2O (ml) K2CO3(ml) (ml) (ml) HAucl4(ml)(ml) 3.3 4 0.2 4 11.8 1 79 5 4 0.2 0.7 15.1 1 79 10 4 0.025 0.1 15.875 1 79 15 4 0.005 0.01 15.987 1 79 3.胶体金的质量鉴定 胶体金制备好后，应进行颗粒直径的测定，金颗粒间大小的均匀度鉴定。 (1)胶体金颗粒直径测定 用预先处理好的覆有Formvar膜的300目镍网浸入胶体金溶液内，取出放在空气中干燥或37℃内烤干。于透射电镜下观察其颗粒大小及均匀度，计算平均直径。如电镜10万倍，照片2.5倍，10万×2.5＝250000＝25nm。理想的金颗粒大小基本相等，均匀一致，无椭圆形及多角形的金颗粒存在。 (2)胶体金颗均匀度的测定 一般需测量100个以上的胶体金颗粒，然后用统计学处理，计算胶体金颗粒的平均直径及标准差。 （3）影响胶体金颗粒大小的因素 如果总数超过10％以上大小不等的金颗粒及椭圆形、三角形金颗存在应重新制备。其原因如下： ①还原剂不是一次快速加入。②容器太大或太小及加温至100℃时间 超过15min。③在室温或4℃保存太久。④低温保存。 四、胶体金探针制备 1.原理 蛋白质在等电点或稍偏碱的情况下，被吸附于胶体金颗粒表面，是根据电荷正负相吸的原理，使其牢固结合，一般胶体金颗粒表面带负电，与蛋白质所带的正电荷基团间靠静电引力作用相结合。 另外，由于蛋白质分子牢固地结合在金颗粒表面，形成一个蛋白层，从而阻止了胶体金颗粒的相互接触，使标记蛋白质的金探针较为稳定。 2.待标记蛋白质 通过透析法除去多余的电解质。长期低温保存的蛋白质，临用前需100000g 4℃离心1h，去除聚合的蛋白质，尤其在浓度高于2mg/ml的情况下。 胶体金免疫检测 主要内容 基本原理 （重点）  一、免疫胶体金技术发展史 二、溶胶的基本概念 三、胶体金的制备方法 四、胶体金探针制备 胶体近免疫层析基本原理 侧流免疫层析 Negative or weakly positive sample Positive sample 夹心法 练习：夹心法还是竞争法？ 思考题： 竞争法中，测试线（test line）上除了固定抗原外，是否可以固定抗体？如果可以，请描述检测原理。 夹心法中，除了双抗体夹心法，是否可用双抗原夹心法？如果可以，请描述检测原理。 一、免疫胶体金技术发展史 1971年Faulk和Taylor首先将兔抗沙门菌抗血清与胶体金颗粒结合，用直接免疫组织化学（Immunohistochemistry, IHC）检测沙门菌的表面抗原。 3.1974年Romano和他的同事们将胶体金标记在马抗人IgG上，实现了间接免疫金染色法。 同年Bauer等报道将胶体金标记在凝集素上的应用。 4.1978年Geoghegan等应用免疫金技术检测B 淋巴细胞表面抗原。5.1981年Danscher建立了银显影液增强光镜 下金颗粒的免疫金银染色方法 （Immunogold-silver staining, IGSS）。