第34章 DNA的复制-2课件.pptVIP

第34章 DNA的复制 本章主要内容 一、DNA的复制 DNA聚合酶 复制的过程 复制的特征 二、聚合酶链式反应 （PCR） 三、DNA的修复 需要模板指导 以四种dNTP为底物 需要有引物，3’-羟基存在 DNA链的生长方向是5’ →3’ 产物DNA的序列与模板互补 DNA复制的过程 DNA复制的特征 背景介绍： 获得大量的DNA 化学合成 基因重组 二、聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR) ※ （一） 定义 （二） 发明 ※ （三） 基本原理 ※ （四） 特点 （五） 发展和应用 （一）PCR的定义 The Nobel Prize in Chemistry 1993 for contributions to the developments of methods within DNA-based chemistry （三）PCR的基本原理 首先使DNA变性,两条链解开, 然后使引物与模板退火,二者碱基配对; DNA聚合酶随即以4种dNTP为底物,在引物的引导下合成与摸板互补的新链。 重复这个过程， DNA以指数方式扩增。 （五）PCR的发展和应用 发展： PCR仪的变迁、PCR的种类 应用： 生物学、医学 PCR仪的变迁 不对称PCR（Asymmertric PCR） 嵌套式PCR（Nested PCR） 原位PCR（In situ PCR） 逆转录PCR（Reverse transcription PCR，RT-PCR） 实时荧光定量PCR (Real time fluorescent quantitative PCR，FQ PCR) 反向PCR（Inverse PCR） 重组PCR（Recombinant PCR） 多重等位基因PCR（Multiplex allele PCR） Anchored PCR; Long fragment PCR; DDRT-PCR; LM-PCR; RACE; Flow chip PCR; Immuno PCR; LP-PCR; NASBA; RFLP-PCR; AFLP-PCR; RAPD-PCR; SSCP; TAS PCR的应用 生物学 基因克隆、人工基因构建、DNA序列测定、 基因定点突变、基因型（突变）检测、 SNP分析、遗传背景分析、生物物种鉴定、系统进化研究、 基因表达量研究（Real-time PCR） 、 基因表达谱研究（ DNA chip, SAGE） 医学 临床医学：遗传病诊断、疾病基因检测（肿瘤诊断）、 病原体检测 法医学： 个体识别、性别鉴定、亲子鉴定 甲型H1N1流感病毒 原理：实时荧光定量逆转录PCR技术 逆转录：RNA→ cDNA 耗时：两个半小时 * DNA聚合反应的特点： DNA聚合酶（DNA polymerase ） 温故: 体内 终止阶段（Termination ） 延伸阶段（ Elongation） 起始阶段（Initiation） SSB 温故: 体内 半保留复制 （semiconservative replication） 半不连续复制 （semidiscontinuous replication） 温故: 体内 体外 1983年，美国Cetus公司的Kary Mullis 发明了聚合酶链式反应（PCR）。 知新： 体外 聚合酶链式反应 (Polymerase Chain Reaction, PCR)： 是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法， 故又称为基因的体外扩增法。 体外 （二） PCR的发明 故事发生在1983年4月 72℃ 94℃ 55℃ PCR循环 在试管中模拟细胞内DNA的复制 DNA聚合酶 美国黄石国家公园的温泉 嗜热水生菌 Taq DNA聚合酶 耐高温DNA聚合酶 Kary B. Mullis (1944-) La Jolla, CA, USA Michael Smith (1932-) University of British Columbia Vancouver, Canada 体外 三个阶段 高温（90~95℃） 变性(Denaturation) 循环（n次） 低温（40~60℃） 退火(复性) (Annealing) 适温（70~75℃） 延伸 (Elongation) 动画 n次循环后DNA序列扩增的数量 No. of No. Amplicon Cycles Copies