Westernblot详细过程..pptVIP

转膜的注意事项（二） 避免直接用手碰杂交膜，使用镊子。因为手上的蛋白和油脂会影响转膜效率并会使膜脏掉。 夹好膜和凝胶后，确定在凝胶/膜和滤纸之间没有气泡存在，否则会导致转膜不完全。 保证膜和滤纸的大小和凝胶完全一样，过大和过小都会影响转膜效率。 鸡来源的抗体与PVDF和尼龙膜有较强的结合能力，从而产生较高的背景，故如果选择鸡来源的抗体最好使用硝酸纤维素膜（NC膜）。 关于磷酸化蛋白检测的注意事项： 保持待测蛋白处于磷酸化状态！在标本提取液中加入足够的磷酸酶抑制剂（NaF，可以防止去磷酸化），并将标本时刻保持在冰浴中！ 使用5%的BSA作为封闭试剂！不能使用脱脂奶粉!（因为脱脂奶粉中含有酪蛋白，会出现很高的背景。） 请谨记蛋白的磷酸化是需要诱导的！当信号低或者无信号时有可能是磷酸化诱导不充分！确保使用阳性对照！ 抗体保存注意事项： 1. 收到抗体后按要求离心后再打开管盖进行分装和保存！ 2. 对于大部分抗体，比较合适的保存方式是分装后保存在 -200C。 2.1 分装的量以一次实验用完为好，最少不能少于10ul每份。因为分装体积越小，抗体的浓度越可能会受到蒸发以及管壁吸附的影响。 2.2 复融后的分装抗体如果一次用不完，将剩余母液保存在40C，避免再冻起来！ 2.3 绝对避免将抗体保存在自动除霜冰箱中。 3. 大部分抗体收到后40C短暂保存1-2周对抗体活性是没有影响的。 4. 长期保存，加入叠氮纳，防止细菌污染 任何时候，绝对避免反复冻融！ * * 温州医科大学药学院 Western blot 详细过程 定义： 印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。 Western Blot是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。 1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上，并利用DNA－RNA杂交检测特定的DNA片段的方法，称为Southern印迹法。 而后人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分析，对RNA的印迹分析称为Northern印迹法，对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为Western印迹法，对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法 Western Blot基本原理 Western Blot：采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物 是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。 经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。 Western Blot一般流程 蛋白样品的制备 SDS聚丙烯酰胺 凝胶电泳 转膜 封闭 一抗杂交 洗涤 二抗杂交 洗涤 底物显色 通过有机溶剂或水溶法制备总蛋白 水溶液提取法 针对水、稀盐、稀酸或碱溶液中的蛋白质。稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂 。 细胞裂解液： 0.5ml水+0.5ml裂解液+10μl蛋白酶抑制剂+ 10μl 泛酸钠+ 1μl pepstain 有机溶剂提取法 对于分子中非极性侧链较多的蛋白质可用有机溶剂提取，包括乙醇、丙酮和丁醇等。 通过层析或电洗脱法制备目的蛋白 蛋白样品的制备 细胞数量达5×106个时就可以做WB。 将细胞裂解液再离心，收集上清液，加loading煮样5min 蛋白样品制备的注意事项： 煮沸5-15min，以充分变性蛋白，保证蛋白从空间结构变为一级结构（多聚体解散为单聚体，氧化状态转化为还原状态等）。有的也可以在700C加热5-10min，尤其适用于多次跨膜蛋白的检测（这些蛋白在煮沸状态下容易聚集，而聚集状态则会影响标本进入凝胶的效率。） SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 原理： SDS 是一种离子性的界面活性剂,它有强离子性的硫酸根离子也带有疏水 性的长碳链.当 SDS 与蛋白质混合时,它会以其碳链与蛋白质之疏水性胺 基酸结合将蛋白质包起来,而以硫酸根离子外露与水分子作用.大多数蛋 白质和 SDS 的平均结合量是 1:1.4 (以重量为单位),而蛋白质和SDS结合后,由于 SDS 带强负价,使蛋白质原先的带电价微不足道,且 每单位重量的蛋白质带电价一致 (charge density),所以决定不同蛋白的泳动速率就只剩下分子大小一项因素 纯净水（ddH2O） 丙烯酰胺和N,N’-亚甲双丙烯