建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒细胞分子生物学和免疫学分析-molecular biology and immunological analysis of jianlan mosaic virus and toothed orchid ringspot virus cells.docxVIP

目 录 HYPERLINK \l _bookmark0 目 录 5 摘要……………………………………………………………………………….……5 ABSTRACT…………………………………………………………………………..6 第一章 兰科植物病毒生物学研究进展…………………………………………….8 1 兰科植物病毒简介 8 1.1 主要兰科植物病毒概述8 1.2 兰科植物病毒的传播方式及地区间差异10 1.3 建兰花叶病毒……………………………………………………..…….10 1.4 齿兰环斑病毒……………………………………………………………11 1.5 建兰环斑病毒………………………………………………………..12 2 常用兰科植物病毒检测方法13 2.1 症状观察及指示植物接种法 .13 2.2 电子显微镜技术14 2.3 血清学方法14 2.4 分子生物学方法15 3 抗病毒基因工程研究进展17 3.1 脱毒快繁17 3.2 卫星RNA研究 21 3.3 D I RNA研究………………………………………………………… 21 3.4 RNA沉默研究…………………………………………………………. 22 3.5 转基因研究23 4 展望 错误！未定义书签。 目录 目录 第 第 PAGE 10 页 共 81 页 第二章 感染建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒的兰花超微结构病变研究26 1 材料和方法错误！ 未定义书签。6 1.1 材料错 误！未定义书签。6 1.2 试剂 错误！未定义书签。6 1.3 方法 26 1.3.1 负染电镜观察27 1.3.2 透射电镜观察27 透射电镜样品包埋制备27 样品的超薄切片27 切片的染色28 超薄切片的电镜观察28 2 结 果28 2.1 病毒粒子形态观察 28 2.2 细胞内病毒聚集体观察28 2.3 细胞超微结构病变观察32 3 讨 论35 3.1 病毒晶体结构 35 3.2 病毒长距离运输 35 3.3 叶绿体病变 36 3.4 线粒体增生 36 3.5 核质变化 36 第三章 建兰花叶病毒与齿兰环斑病毒的分子鉴定37 1 材料与方法 37 1.1 材料 37 1.2 分子生物学试剂 38 1.3 引物设计 38 1.4 方法 38 1.4.1 植物总RNA的提取 38 1.4.2 复合RT-PCR 39 1..4.2.1 cDNA第一链转录 39 MPCR反应体系 39 1.4.3 单链构象多态性分析（PCR-SSCP） 40 2 结 果 40 2.1 CYMMV和ORSV CP基因的普通RT-PCR扩增 40 CYMMV和ORSV CP基因的多重RT-PCR扩增 41 CymMV和ORSV CP基因的PCR-SSCP鉴定 42 2.4 蝴蝶兰杭州分离物 CymMV和ORSV CP基因的多重RT-PCR鉴定 43 2.5 序列鉴定和同源性分析44 3 讨 论 46 第四章 建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒外壳蛋白基因原核表达及多克隆抗体制备 .48 1 材料与方法 48 1.1 材料 48 1.1.1 菌株、载体与试验动物49 1.1.2 分子生物学试剂49 1.1.3 普通化学试剂和免疫学试剂49 1.2 引物设计析 49 1.3 方法49 1.3.1CymMV和ORSV目的基因片段的PCR扩增 49 1.3.2 扩增产物的纯化50 1.3.3 重组质粒pET32c-CymMV-cp和pET32c-ORSV-cp的构建 51 1.3.4 重组质粒在大肠杆菌中的表达53 1.3.5 表达蛋白的纯化及浓度测定55 1.3.6 多克隆抗体的制备57 2 结 果 58 2.1 目的基因扩增与重组表达载体的PCR鉴定 58 2.2 重组质粒的测序鉴定60 2.3 目的基因表达产物的SDS检测 60 2.4 多克隆抗体的制备、效价测定及WESTERN BLOT特异性检测 61 3 讨 论 63 总结65 参考文献 66 附录：常用试剂及配制75 摘要 摘要 摘 要 建兰花叶病毒（Cymbidium mosaic virus，CymMV）和齿兰环斑病毒（Odontoglossum ringspot virus，ORSV）是侵染兰花最常见的两种病毒。它们使兰花叶片形成褪绿条纹、凹 陷的灰白斑或坏死圈斑等症状，导致植株生长不良、开花小而少，花期缩短，给花卉生产造 成严重损失。CymMV隶属线形病毒科（Flexiviridae）、马铃薯X病毒属（Potexvirus），病毒 RNA基因组全序列约 6-7 kb，与该同属的其它成员有很高的同源性。整个基因组由 5 个开放 读码框架（ORF）构成，其中CP基因是完整地ORF5框，