细胞生物学技术 知识课件细胞转染与传代.pptVIP

细胞转染和传代 实验目的： 理解细胞转染的原理,掌握细胞转染的操作步骤。 学习操净台内操作及注意事项 掌握贴壁细胞传代方法和细胞计数板的使用 学习荧光显微镜的结构、操作及注意事项。 关于转染（transfection） 细胞转染是指将外源的DNA，RNA等导入真核细胞 的技术，是实验室工作中经常涉及的基本方法。 外源核酸在细胞中的定位 物理介导：电穿孔法、显微注射 化学介导：磷酸钙共沉淀法、脂质体转染方法 生物介导：病毒介导法 常用的转染方法 细胞转染的类型 瞬时转染：外源DNA/RNA不整合到细胞的染色体中，因此一个细胞中可存在多个拷贝数，产生高水平的表达，但通常只持续几天（24-72小时）。 稳定转染：外源DNA可以整合到细胞的染色体中，通常需要经过反复筛选才能得到稳定转染的同源细胞系。 脂质体转染细胞的原理 脂质体转染细胞的优点：操作方便，安全性高。 关于荧光蛋白 Aequorea victoria水母 GFP 在细胞生物学与分子生物学领域中，绿色萤光蛋白基因常被用作为一个报告基因(reporter gene)。 利用DNA重组技术，将目的基因与GFP基因构成融合基因，转染合适的细胞进行表达，然后借助荧光显微镜便可对标记的蛋白质进行细胞内活体观察。由于GFP相对较小，只有238个氨基酸，将其与其他蛋白融合后不影响自身的发光功能 。 可用于特定蛋白、各种细胞结构的标记定位。 GFP还常被用作荧光探针。利用信号转导中信号分子的迁移功能，将荧光蛋白与信号分子相偶联，根据荧光蛋白的分布情况即可推断信号分子的迁移状况，并推断该分子在迁移中的功能。  绿色荧光蛋白的应用 subcellular localization 带标签的重组蛋白 Recombinant protein RFP-tag GFP-tag co-localization Protein1. Protein2. mRFP-H2B GFP-B23 GFP-SENP3 RFP-B23 关于GFP载体 pEGFP-N1载体具有以下几方面特点： ①该质粒具有很强的复制能力，可以随宿主细胞分裂时跟随细胞质成分遗传给新生的子细胞，这是保证目的基因稳定表达的因素之一。 ②含有高效的功能强大的启动子SV40和PCMV，可以使目的基因在增殖的细胞中稳定表达。 ③具有多克隆位点，便于目的基因的插入。 ④该载体具有neo基因，可以采用G418来筛选已成功转染了该载体的靶细胞。 这些特殊的结构可以实现目的基因在靶细胞内的 稳定表达 实验材料 HO8910：人卵巢癌细胞系 转染质粒：pEGFP-N1载体，带有荧光蛋白基因的空质粒。 脂质体：HilyMax阳离子脂质体，可应用于转染贴壁 或悬浮细胞的瞬转及稳转，适用于含血清的培养基， 细胞毒性低，效率高且稳定，也能用于转染siRNA。 转染培养液：Opti-MEM，营养条件较好的无血清培养液，在含血清培养液中生长的大多数细胞都能转移到 Opti-MEM中。 转染实验时间安排 第1次操作----形成DNA-脂质体复合物: 1μg DNA(3μl)加入 120μl的OMEM中，轻弹混匀，再加入3μlHilyMax脂质体，轻 弹混匀，室温放置15-25分钟。 第2次操作----复合物加入到细胞培养皿中：吸取全部复合物，缓慢均匀滴加入培养皿，轻缓混匀。 培养箱培养，第二天中午用荧光显微镜观察转染效果。 转染实验操作注意事项 1.进入细胞培养室前带上口罩 2.操作前用75%酒精消毒双手 3.操作在超净台内进行 4.根据需要选择合适的移液枪 5.做好标记 超净台 移液枪 移液枪枪头 传代 (passage,subculture)： 当细胞在培养容器中增殖到一定密度，生存空间及营养物质缺乏，需按一定比例分离，接种至新的培养容器并更新培养液，这个过程称为细胞传代。 一代: 细胞接种后到下一次传代的一段时间；可增殖几次。 培养细胞一代的三个阶段：潜伏期、指数增生期、平台期 实验研究多在指数增长期进行 细胞的传代培养 一定密度 “汇片” 接种 平台期: 有活力，无增殖 贴壁 铺展 体积变大、数目增多 潜伏期： 有活力，无增殖 传代 指数增长期: 快速增殖， 增殖几次 细胞数量 培养细胞一代的增殖过程 传代培养的实验原理: 　　传代培养是组织培养常规保种方法之一,也是几乎所有细胞生物学实验的基础。传代要在严格的无菌条件下进行，每一步都需要认真仔细的无菌操作。(本次实验因条件限制，只能在一个模拟的环境下进行实验) 贴壁细胞消化后的应用： 1. 继续传代培养 2.计数、计算细胞活力，了解细胞的生长状况。 3.制备细胞悬液，以备后期的继续实验。（重新铺板，MTT实验；标记、流式分析、分选；爬片、免