生化工程下游技术 知识课件第七章双水相萃取技术 知识.pptVIP

第七章 双水相萃取技术 ;; 特点： (1) 条件温和，保留产物活性 (2) 含水量高，表面张力低，耗能少 (3) 大分子及小分子萃取 (4) 易于放大 (5) 影响因素复杂 (6) 成本高 ;;;;第二节 双水相分离理论 ; 对于大分子间的混合，熵和分子间作用力相比，后者决定混合效果。两种被混合分子间如存在空间排斥力．它们的线团结构无法互相渗透，同种分子会集聚在一起，而排斥异种分子，在达到平衡后就有可能分成两相，形成双水相。 某些聚合物与一些无机盐相溶液相混合时，只要浓度达到一定范围，也会形成二相，如聚乙二醇（PEG）与碱性磷酸盐或硫酸盐之间形成的两相。 ;生化工程中常用的双水相体系;B. 其中一种为带电荷的聚电解质。 C. 两种都为 聚电解质。 D. 一种为聚合物。一种为盐类。;在疏水性次序表中，距离越远则分相越容易。;二、相图;杠杆定律;;三、物质在两相中的分配 ;1、表面自由能的影响 ：;2、表面电荷的影响 ：;3、综合考虑：;四、影响分配平衡的参数 ;蛋白质的分配系数随葡聚糖分子量的增加而增加。;2、体系中无机盐离子的影响 ;;3、体系pH的影响 ;（4）体系温度的影响 ;;;第三节 双水相萃取的应用 一、双水相萃取的工艺流程：;;要成功地运用双水相萃取的方法，应满足下列条件： （1）欲提取的酶和细胞碎片应分配在不同的相中； （2）酶的分配系数应足够大，使在一定的相体积比时，经过一次萃取，就能得到较高的收率； （3）两相用离心机很容易分离。 ;;酶的提取纯化: 酶主要分配在上相，菌体在下相或界面;;B.核酸的分离纯化 PEG/Dextran体系 盐组成的微小变化将引起分配系数的急剧变动。;C.人生长激素的提取;D.病毒的分离纯化 控制不同的NaCl浓度可使病毒全部分配在上相，或下相。;三、具体操作：;; 放大过程中遇到的主要问题是含细胞碎片相的粘度问题和达到萃取平衡所需的时间以及相与相的分离问题。 ;; 一般来说，脱除聚合物的方法主要有：萃取、超滤、电泳和色谱分离等，但是这些方法既费时，且费用又大。而温度诱导双水相相分配技术，能不借助于其它手段，就可达到将目标产物和成相聚合物分离，是一种价廉、实用的方法。 1、膜分离：超滤、渗析 2、聚乙二醇中蛋白质通过加盐来精制 3、离子交换和吸附 4、电泳和双水相体系结合 5、亲和分配和双水相体系结合 ; 采用智能聚合物构成双水相萃取则只需要简单的改变外界条件，将成相聚合物沉淀下来，即可实现相分离，蛋白质留在上清液。然后将沉淀的聚合物重新溶解，可再次使用，从而为解决上述问题提供一条高效途径。 温敏聚合物在双水相系统中的应用更受重视，因为热分离过程中无需添加化学组分，简化了产品的后分离。虽然聚乙二醇也是一种温敏聚合物，但是它的临界温度太高(100℃以上)，不可能应用于生物大分子的分离。 在过去的十几年中已经合成出许多种新型的、临界温度大大降低的温敏聚合物，如聚Ｎ异丙基丙烯酰胺、聚Ｎ乙烯基己内酰胺或两者的共聚物、甲基纤维素、聚乙烯甲醚、乙基-羟乙基纤维素等。;热诱导相分离;pH 诱导相分离;第四节 双水相萃取技术的发展;当改变体系多聚物以提高体系选择性仍旧满足不了对目的物纯度和得率的要求时，通常采用多级萃取。Blomquist和Albertsson在实验室首先用图11的多级萃取柱分离核酸、蛋白质和一些小的质粒。;工作流程如上图所示，上、下相逆向流动。或固定其中一相（往往是下相），物质在逆向流动中达到分配平衡。柱内的搅拌是维持稳定操作的重要参数。多级萃取柱的放大，还涉及到许多复杂的方面，因此工业上的运用有待进一步的研究。;3、与其它技术相结合，提高分离效率 1）双水相体系同生物转化相结合 避免体系对酶或菌体的毒性，消除产物抑制效应 2）双水相萃取与膜分离技术结合 可解决乳化和生物大分子在两相界面的吸附等问题，加快萃取速率。 3）双水相萃取同亲和层析相结合 存在问题： 1、双水相萃取技术还不十分成熟，技术上还没有达到最佳操作。 2、常用的聚合物价格昂贵，开发新的聚合物是该技术急需解决的问题。;enzyme;enzyme; 人生长激素提取应用举例二; 廉价高聚物-高聚物双水相体系可降低生产成本。 比较成功的例子是用变性淀粉PPT （hydroxypropyl derivative of starch）代替昂贵的葡聚糖。PPT/PEG体系已被成功地用来从发酵液中提取过氧化氢酶、半乳糖苷酶等。 PPT-PEG体系除比PEG-盐体系稳定，和PEG／Dextran体系的相图非常相似外，还具有一些特殊的优点：; ①蛋白质溶解度大 蛋白质在PPT浓度为15％以前不