免疫分析法讲解课件.pptxVIP

第三章 免疫分析法 ;4.1 概述 4.2 抗原或抗体的检测方法 4.3 抗体的制备 4.4 抗体纯化技术;3;4;5;人源的免疫球蛋白的物理化学属性;7;8;9;三、抗原与抗体反应的特点; 2. 抗原与抗体结合的可逆性 抗原抗体的结合反应是一个可逆的反应 Ab+Ag Ab:Ag 由于抗原抗体结合的可逆性，可利用亲和层析法分离纯化抗原或抗体；利用待测抗原和标准抗原与抗体的竞争结合，进行抗原或抗体的定量测定，如放免检测法、酶联免疫吸附法等; 3、抗原与抗体反应中量的关系 当抗体与抗原结合时，如果是颗粒抗原，则出现凝集现象；如果是可溶性抗原，则产生沉淀作用。这些可见现象的出现是以抗原与抗体反应特异性和亲和力为基础的，同时也是抗原抗体反应的继发过程。 当抗原与同型抗体相遇时，在合适条件下，不论彼此量的多少，都立即发生特异性的结合形成抗原抗体复合物，这一过程通常只需要几秒的时间便可完成，称为反应的一级阶段。; 在一级阶段之后，继发出现抗原与抗体间进一步交联而形成网络状凝集物，进而出现可见的凝集和沉淀，称为反应的二级阶段。这一阶段是抗原抗体网格生长的阶段，速率要慢的多，且在很大程度上依赖于温度、离子强度等外界条件，但更重要的是需要合适的抗原抗体分子比例。只有当二者的结合价彼此饱和时，才能连接成一个大网格样凝集物，出现凝集或沉淀。 ;在一定量抗体存在下抗原与抗体反应的数量关系及机理;（一）电解质 抗原和抗体有对应的极性基团，能相互吸附并由亲水性变为疏水性。电解质的存在使抗原-抗体复合物失去电荷而凝聚，出现可见反应，故免疫学试验中多用生理盐水稀释抗原或抗体。 （二）酸碱度 抗原抗体反应的最适pH是6~8。超出此范围可影响抗原、抗体的理化性状，出现假阳性或假阴性。;（三）温度 适当的温度可增加抗原与抗体分子碰撞的机会，加快二者结合速度。抗体-抗原反应的最适温度为37℃。某些抗原-抗体反应有其独特的最适温度，如冷凝集素在4℃左右与红细胞结合最好，20℃以上反而解离。此外，适当震荡或搅拌也可促进抗原-抗体分子的接触，提高??合速度。 ;（四）抗原和抗体的性质 抗体的特异性和亲和力是决定抗原-抗体反应的关键因素。从免疫早期动物所获抗血清其亲和力一般较低，而后期所得抗血清一般亲和力较高；单克隆抗体亲和力较低，一般不适用于低灵敏度的沉淀反应和凝集反应。此外，抗原理化性质、抗原决定基多寡和种类等均可影响抗原-抗体反应。 抗原和抗体的浓度、比例对抗原-抗体反应的影响最大，是决定性因素。;3.2 抗原或抗体的检测方法;1. 液相沉淀反应;（1） 絮状沉淀试验;(2) 环状沉淀试验; 在一定量抗体中分别加入递增量的抗原，经一定时间形成免疫复合物，液体混浊。用浊度计测量反应体系的浊度，可绘制标准曲线并依据浊度推算样品中抗原含量。该法快速简便，近年来发展很快，已建立数种不同类型的测定方法，如透射比浊法、散射比浊法、免疫胶乳比浊法以及速率抑制免疫比浊法等。 ;2. 凝胶扩散沉淀; 将一定量已知抗体混于琼脂凝胶中制成琼脂板，在适当位置打孔并加入抗原)。; (2) 双向免疫扩散 将抗原和抗体分别加入琼脂凝胶的小孔中，二者自由向四周扩散，在相遇处形成沉淀线。若反应体系中含两种以上抗原-抗体系统，则小孔间可出现两条以上沉淀线。本法常用于抗原或抗体的定性检测、组成和两种抗原的相关性分析。;双向免疫扩散的应用; ;3. 免疫电泳技术;（1） 火箭免疫电泳;原理：双向扩散+ 电泳 比双向扩散试验灵敏度提高8～16倍;（3）血清免疫电泳;二、凝集反应 细菌、红细胞等颗粒性抗原与相应抗体结合后，在一定条件下出现肉眼可见的凝集物，此为凝集反应(agglutination)。; 1. 直接凝集 细菌或红细胞与相应抗体直接反应，可出现细菌或红细胞凝集现象。其方法为：①已知抗体与相应抗原在玻片上反应，用于抗原的定性检测（如ABO血型鉴定、细菌鉴定）；②在试管中连续稀释待检血清，加入已知颗粒性抗原，用于抗体的定量检测（如诊断伤寒病的肥达试验）。 ;2. 间接凝集 将可溶性抗原包被在与免疫无关的载体颗粒表面，再与相应抗体反应，出现颗粒物凝集现象。常用载体为人O型血红细胞、聚苯乙烯乳胶颗粒等。; 3. 间接凝集抑制试验 其原理是：将待测抗原（或抗体）与特异性抗体（或抗原）先行混合并作用一定时间，再加入相应致敏载体悬液；若待测抗原与抗体对应，即发生中和，随后加入的相应致敏载体颗粒不再被凝集，使本应