免疫学原理与技术答辩讲解课件.pptxVIP

靶向Del-1蛋白的肿瘤血管阻断剂与新生血管抑制剂双效抗体药物的制备答辩人指导老师龙益如王慧编辑标题团队成员窦 华妤学海敏雅长：龙益录ContentsPart 1Part 2Part 3绪 论研究思路与方法应用前景Part 1绪 论选题背景相关研究状况研究意义1.1 选题背景恶性肿瘤成为威胁世界人民健康的致命因素针对肿瘤的预防、检测和治疗的研究成为热点四个观点肿瘤微环境和新生血管是近期药物研究的热门靶点Del-1蛋白靶点的发现为药物研发提供新方向 Del-1（developmental?endothelial? locus-1）最早被发现是一种在胚胎血管生成过程中由内皮细胞分泌的ECM蛋白，具有促进血管形成的作用，是一种重要的血管再生因子和免疫调节因子。1.1 选题背景 Del-1蛋白含有三个重复表皮生长因子EGF样结构域和两个盘状结构样结构域。其第二个EGF结构域（EGF2）包含一个可结合整合素的重要模体，RGD模体（Arg-Gly-Asp），两个盘状结构域则可结合磷脂酰丝氨酸，特殊的结构决定了Del-1在细胞微环境中发挥的功能。1.2 相关研究情况1.Del-1促肿瘤血管生成作用1.2 相关研究情况2.Del-1促进肿瘤生长及转移结合αvβ31.3 研究意义学术研究意义01Del-1作为肿瘤发生发展过程中重要的胞外基质蛋白，抗Del-1蛋白抗体药物的制备，将为该靶点的实际应用提供相应方法，也对肿瘤微环境中其他靶点的研究提供参考。经济效益02制成制备相应抗体药物可用于肿瘤检测和治疗，将会有很大经济效益。社会效益03可用于治疗肝癌、胰腺癌、肺癌、大肠癌等癌症肿瘤，为恶性肿瘤治疗提供新的选择，帮助病人减轻病痛，提高其生活质量。Part 2研究思路与方法理论依据研究思路可行性说明2.1 理论依据理论依据一Del-1蛋白在肿瘤微环境中高表达，在正常人组织器官中仅部分部位表达如眼等。Del-1蛋白在肿瘤新生血管生成、抗肿瘤血管内皮细胞凋亡以及肿瘤转移和复发等多信号通路中发挥重要作用。3理论依据二个依据研究的三个理论依据凝血酶原在凝血机制中起到中心作用，且其转化为凝血酶之后才具有相应活性，而凝血酶原和Del-1蛋白在与整合素结合均依赖RGD模体，可能存在共同抗原。理论依据三单克隆抗体的制备技术和小分子抗体制备方法为我们提供了技术手段。2.2 研究思路Del-1蛋白靶点切断运粮通道C抗体导弹BD兵马未动粮草先行亲和力、凝血酶原EA思路2.2.1 Del-1相关情况DEL-1蛋白的3D构型2.2.1 Del-1相关情况分子量及其特征2.2.1 Del-1相关情况Del-1蛋白的序列展示2.2.1 Del-1相关情况Del-1蛋白中EGF-2的结构域放大2.2.1 Del-1相关情况实验所用具体材料2.2.2 抗Del-1蛋白的单克隆抗体的制备材料动物免疫饲养细胞的制备瘤细胞SP2/0的制备1234免疫脾细胞的制备细胞融合阳性杂交瘤细胞的筛选和克隆培养基及血清：胎牛血清、RPMI 1640培养基；试剂：HT、HAT、PEG3500、CFA、IFA、DMSO；细胞系：骨髓瘤细胞系 SP2/0 本校实验室保存；Balb/ C 小鼠若干；567细胞冻存与复苏单抗腹水的制备及效价的测定89采用盐析法提纯单克隆抗体，对A-J分别执行如下操作，调节样品pH值，加入正辛酸（25ul/l），搅拌30min；室温高速离心（10000g，30min），收集上清液；再加入硫酸铵（40%饱和度）；4℃高速离心（10000g，15min），弃去上清液；用PBS溶解沉淀，可得到比较纯的单克隆抗体A-J溶液。将各株单克隆抗体分别用胃蛋白酶进行酶切修饰，然后采取凝胶层析法－用Sephadex G-100分离F(ab’)2，具体操作不再赘述； 测定 F(ab’)2的分子量、亲和力、特异性、效价等。1.单克隆抗体的纯化2.获取纯化的F(ab)2及鉴定2.2.2 抗Del-1蛋白的单克隆抗体的制备2.2.3 筛选满足亲和力条件的抗体一、假设小分子抗体与凝血酶原能够结合凝血酶原Del-1抗体肿瘤细胞血管Del-12.2.3 筛选满足亲和力条件的抗体 酶免疫技术法（ELISA）：（1）将单位量Del-1蛋白吸附于固相载体上，洗涤，封阻。（2）用辣根过氧化物酶（HRP）根据过碘酸盐氧化交联法进行抗体标记,将酶标抗体加入孔内。（3）洗涤未反应物。（4）加入底物（TMB）。（5）加入浓硫酸终止反应，测OD值，检测显色反应的程度，记录。（6）加入第二种抗体（单位量），重复前面步骤，直至全部检测完。（7）根据显色程度大