碱裂解法质粒小量提取 文档.docVIP

碱裂解法质粒小量提取 试验原理： JQhwH9 ?碱裂解法是较常用的提取的方法。其优点是收获率高，适于多数的菌株，所得产物经纯化后可满足多数的DNA重组操作。十二烷基磺进行质粒的小量制备。十二烷基磺酸钠（SDS）是一种阴离子表面活性剂，它既能使细菌细胞裂解，又能使一些蛋白质变性。用SDS处理细菌后，会导致细菌细胞破裂，释放出质粒 DNA和染色体DNA，两种DNA在强碱环境都会变性。由于质粒和主染色体的拓扑结构不同，变性时前者虽然两条链分离，却仍然缠绕在一起不分开；但后者完全变性分甚至出现断裂，因此，当加入pH4.8的酸性乙酸钾降低溶液pH值，使溶液pH值恢复较低的近中性水平时，质粒的两条小分子单链可迅速复性恢复双链结构，但是主染色体DNA则难以复性。在离心时，大部分主染色体与细胞碎片，杂质等缠绕一起被沉淀，而可溶性的质粒DNA留在上清夜中。再由异丙醇沉淀、乙醇洗涤，可得到纯化的质粒DNA。碱裂解法提取的质粒DNA可直接用于酶切、PCR扩增、银染序列分析等。仪器与主要试剂 主要试剂：????? 溶液I：?50 mmol/L　葡萄糖 ???????????????????????? 10 mmol/L　EDTA ???????????????????????? 25 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)??????????????? 溶液II：200 mmol/L NaOH ?1% SDS ??????????????? 溶液III：?3 mol/L NaAc (pH4.8)溶液 95%乙醇 %70乙醇 TE缓冲液：10 mmol/L Tris-HCl ,pH 7.5 1 mmol/L EDTA方法： 1．将大肠杆菌菌落挑取一环接种在含有2毫升加入抗菌素的LB液体培养基的10毫升试管里，37振培过夜，16～18小时 2．转移以上菌液1.5毫升于EP管中，8000rpm离心30秒 3．小心去除上清，并用吸水纸吸干残余液体，再将沉淀物在振荡器上振匀 4．加入溶液I 100μl，盖紧EP管盖，翻转数次，冰上放置10分钟 5．加入溶液II 200μl，温和翻转EP管5次(可观察到溶液逐步由混浊变为透明)，冰上放置5分钟 6．加入溶液III 150μl，将EP管盖紧后累累来回翻转23次，混匀后冰上放置20分钟 7．12000rpm离心15分钟 8．将上清转移到另一个EP管中(吸取时不可吸入底部的沉淀)。加入等体积的酚和氯仿：异戊醇各抽提一次 9．加入1毫升预冷的无水乙醇和1/10体积的NaAc(3 mol/L,pH5.2)，盖紧，并翻转EP管数次混匀 10．?? 置于-20冰箱1～2小时 11．?? 15000rpm离心15分钟，去除上清，收集管底白色沉淀 12．?? 70%乙醇洗涤一次，空气干燥或真空抽干 13．?? 将沉淀溶于50μl TE缓冲液或去离子水，完全溶解后，-20保存 （1）溶液Ｉ:pH8.0 GET缓冲液（50mmol葡萄糖，10mmol/LEDTA，25mmol/L Tris－HCl）；溶液Ｉ可成批配制，在10 lbf/in2(6.895x104Pa)高压下蒸气灭菌15min，贮存于４。葡萄糖的作用是使悬浮后的大肠杆菌不会很快沉积到管子的底部，增加溶液的粘度，维持渗透压及防止DNA受机械剪切力作用而降解。EDTA是Ca2＋ 和Mg2＋等二价金属离子的螯合剂，在溶液I中加入EDTA，是要把大肠杆菌细胞中的二价金属离子都螯合掉。从而起到抑制DNase对DNA的降解和抑制微生物生长的作用。 Uo!#pw)p溶液：0.2mol/LNaOH(内含1%的SDS)，这个用的时候需现配。要新配置溶液是为了避免NaOH接触空气中的CO2而减弱了碱性。NaOH是最佳溶解细胞的试剂。不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了碱都会在瞬间溶解，这是由于细胞膜发生了从bilayer（双层膜）结构向micelle（微囊）结构的相变化。用不新鲜的0.4 N NaOH，即便有SDS也无法有效溶解大肠杆菌。SDS是离子型表面活性剂。它主要作用是：a溶解细胞膜上的脂质与蛋白，从而破坏细胞膜。b解聚细胞中的核蛋白。c能与蛋白质结合成为R-O-SO3-…R＋-蛋白质的复合物，使蛋白质变性而沉淀下来。SDS能抑制核糖核酸酶的作用，所以在接下来的提取过程必须把它去除干净，以便下一步试验的更好进行。溶液：pH4.8乙酸钾溶液（60ml 5mol/L KAc，11.5ml冰醋酸，28.5mlH2O）；该溶液钾离子浓度为3mol/L，醋酸根离子浓度为5mol/L.pH4.8的乙酸钾溶液是为了把抽提液的pH调至中性，从而使变性的质粒DNA复性，且稳定存在。溶液III加入后的沉淀实际上是K+置换了SDS中