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不动杆菌产AmpC酶和超广谱β-内酰胺酶调查 毕业学生：陈 群 广州医学院医学检验系2000级 指导老师：叶惠芬 陈惠玲 广州市第一人民医院检验科 近年来，由于广谱抗生素的广泛应用，耐药革兰阴性杆菌感染已成为抗感染治疗中的主要问题，不动杆菌属作为条件致病菌，其引起院内感染的重要性也日益突出，并且，不动杆菌属对目前使用的多种常用抗生素均有较强的耐药性，治疗十分困难。 我们对临床分离的69株不动杆菌进行了产酶和耐药性调查，结果报告如下。 材 料 和 方 法 一、材料 1. 菌株来源 69株不动杆菌分离自广州市第一人民医院2004年1月--2004年10月病房及门诊的各类培养标本，其中54株来自痰标本，5株来自伤口分泌物，6株来自尿液，腹水、组织、全血及前列腺液各分离1株。 2. 试验材料 M-H培养基及所用抗生素纸片均为英国OXOID公司产品。 二.方法 1.菌株的分离鉴定 细菌的分离按常规操作规程进行，菌株用VITEK-2全自动细菌鉴定仪进行鉴定。 2.药敏试验 采用纸片扩散法（K-B法）进行药敏试验并按 NCCLS制定的标准进行，用大肠埃希菌ATCC25922、ATCC35218和铜绿假单胞菌ATCC27853作质量控制；用WHO提供的WHONET5.3软件进行统计分析。 3.粗提酶液制备 将新分离的待检菌密涂于1/4MH琼脂平板（直径90mm）上。35oC培养24h后，用接种环取下全部菌苔于1ml灭菌生理盐水中（用1.5ml离心管），置-70oC低温冰箱反复冻融7次（要冻2h以上，再取出融化）。 在4oC条件下10000r/min离心45min，吸取上清液；取1滴粗提液接种于MH琼脂平板上，35oC培养24h，无菌生长（以无菌生长为合格的粗提液），置-70oC低温冰箱保存。 4. AmpC酶和ESBLs的检测 采用三维试验法（1）AmpC酶检测：按标准的 扩散法操作，将0.5麦氏单位大肠埃希菌ATCC25922菌液均匀涂布于MH琼脂平皿，取30μgFOX纸片置于平皿中心 使用自制刀片在离纸片边缘5mm处放射性地由里到外切割一道狭缝（15mm×1mm），用微量加样器取40μl酶粗提液加入狭缝内，避免酶液溢出狭缝。 将培养基置35oC孵育过夜。若观察到狭缝与抑菌圈交接处出现扩大的长菌区域，视为三维试验阳性，说明该酶提取液中有AmpC酶。 (2)ESBLs检测：用30μgCRO取代FOX，用36μl酶粗提液加上4μl的2mmol/L邻氯西林取代40μl酶粗提液，其余操作同(1)。 肺炎克雷伯菌ATCC700603为ESBLs阳性对照，阴沟肠杆菌029M为AmpC酶阳性对照，阴沟肠杆菌029作为AmpC酶阴性对照，大肠埃希菌ATCC25922为ESBLs阴性对照。 结 果 1.检测结果(见表1) 表1 不动杆菌属产AmpC酶和ESBLs比较 　 酶型　　　 株数　　　 比例（%） 　AmpC酶　　 17　　　 24.6 ESBLs　　　 18　　　 26.1 AmpC酶+ESBLs 4 5.8 2、对常用抗菌药物的耐药情况。(见表2) 讨 论 不动杆菌广泛存在于自然界、医院环境及人体皮肤，是一类专性需氧的条件致病菌。在非发酵菌感染中，仅处于假单胞菌属。 近几年来检出率有上升的趋势，引起各部位感染的报告也越来越多，不仅可引起伤口感染、菌血症、脑膜炎、泌尿系感染，还可以在住院病人中，尤其在重症监护病房中引起医院获得性肺炎，成为严重的医院感染病原菌。 在Bushβ-内酰胺酶分类表中，不动杆菌属仅可产生两大类三小类共九种β-内酰胺酶，而近几年研究表明不动杆菌可产生三大类六小类共13种β-内酰胺酶，主要为各种不同类型的AmpC酶和ESBLs，而且检出多种碳青霉烯酶。 ESBLs在Bush分类法中属于2be型,在Ambler分类法中属于A群，能与β-内酰胺环的羧基共价结合使酰胺键水解，特别是能水解第三代头孢菌素和单酰胺类如氨曲南，导致能产该酶的细菌对此类抗生素耐药。 AmpC酶是头孢菌素酶，为Bush分类C组1型酶，主要存在于肠杆菌属、枸橼酸杆菌属、沙雷氏菌属等肠杆菌科、铜绿假单胞菌属和不动杆菌属中。产AmpC酶的细菌对头孢菌素类和头霉素类及β－内酰胺酶抑制剂耐药。 ESBLs和AmpC酶的主要区别在于前者可以被克拉维酸等酶抑制剂抑制、对头霉素类抗生素敏感以及不会被邻氯西林抑制，而后者不会被克拉维酸抑制、对头霉素类抗生素耐药、能被邻氯西林抑制以及对第四代头孢类抗生素敏感。 三维试验因预先用反复冻