实验1 植物基因组DNA的分离与RAPD.pptVIP

实验一 植物基因组DNA的分离纯化及RAPD扩增 一、实验原理 核酸在细胞中都是以与蛋白质结合的状态存在。95%的真核生物DNA主要存在于细胞核内，其它5%为细胞器DNA，如线粒体、叶绿体等。 盐溶法是提取DNA的常规技术之一。在制备核酸时，通常首先是破坏细胞壁和细胞膜，使核蛋白被释放出来；利用DNA不溶于0.14mol/L 的NaCl溶液而RNA能溶于0.14mol/L 的NaCl溶液这一性质可以将DNA核蛋白和RNA核蛋白从样品破碎细胞液中分开；然后进一步将DNA和蛋白质等杂质分离开来。 1. 植物基因组DNA的分离纯化 去除蛋白的方法有3种： ① 用含辛醇或异戊醇的氯仿使蛋白质变性，使其与核酸分离。 蛋白质停留在水相和氯仿相中间，而DNA则溶于上层水相； ② 用SDS、CTAB等去污剂使蛋白质变性，使其与核酸分离。 ③ 苯酚处理，也可将DNA与蛋白质分离开来。这时DNA溶于上层水相，蛋白变性后则停留在酚层内。 反复使用上述方法多次处理DNA核蛋白溶液，就能将蛋白等杂质较彻底地除去，得到较纯的DNA制品。再用两倍体积95%乙醇溶液可将DNA钠盐沉淀出来。 本实验采用CTAB法从植物幼苗中提取基因组DNA。 另外，生物材料中含有的脂肪物质和多糖，在用盐溶液分离核蛋白以及乙醇或异丙醇分级沉淀时即可被除去。为了彻底除去DNA制品中混杂的RNA杂质，可用RNA酶进行处理。 核酸纯化目标：纯化后的核酸样品中不应该存在 对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的重金属离子； 其它生物大分子物质如蛋白质、多糖和脂类分子的污染 应降到最低程度；排除RNA分子污染。 操作注意事项：尽量简化操作步骤，缩短提取过程 减少各种有害因素对核酸的破坏；减少化学因素对核酸 的降解，一般pH4-10；减少物理因素如机械切力、高温 对核酸的降解。 提取步骤：破碎细胞，去除与核酸结合的蛋白质、 多糖和脂类分子，去除RNA、盐类、有机溶剂等杂质。 提取方案：视具体材料和待提取核酸的特点而定。 二、仪器设备 高速离心机、水浴锅、电子天平、冰箱 三、材料及试剂 1. 材料：水稻幼苗 2. 试剂： ① 2×CTAB提取液(内含2%CTAB、1.4mol/L NaCl、25mmol/L EDTA、0.2%?-巯基乙醇和0.1mol/LTris-HCl，pH8.0)： 取2g CTAB、8.18gNaCl、0.74g EDTA-Na2.2H2O，加入10ml 1mol/L的Tris-HCl(pH8.0)和0.2ml?-巯基乙醇，加双蒸水(ddH2O)定容到100ml； ②氯仿:异戊醇(24:1) ③洗涤缓冲液(70%乙醇，内含10mmol/L乙酸铵)：取70mL无水乙醇和0.077g乙酸铵，加双蒸水定容到100ml； ④ 无水乙醇、70%乙醇； ⑤ TE缓冲液：内含10 mmol/L Tris-HCl、1 mmol/L EDTA，pH8.0 四、操作步骤 ① 取水稻幼苗，于Eppendorf 管中，液氮研磨成粉，加 入0.7ml 60℃水浴中预热的2×CTAB提取液和20 ?l ?- 巯基乙醇，轻轻转动使之混匀； ②　样品于60℃温浴约40min，每5min将Ep管颠倒混匀； ③　加入等体积氯仿:异戊醇(24:1)，轻轻颠倒混匀，室 温下放置5min，6000g离心10min。 ④　上层溶液转入另一个干净Ep管中，加入等体积的氯仿:异戊醇(24:1)混匀，６000g转离心5min； ⑤　重复步骤④ 2-3次，直至无白色界面物质 ； ⑥　将上层水相吸入另一干净的离心管中，加入2/3体积的预 冷异丙醇，轻轻混匀使核酸沉淀下来。在-20℃下放置 30min，4℃、10000g转离心10min，弃上清液； ⑦　沉淀用1ml洗涤缓冲液洗涤，10000g离心1-2min； ⑧　沉淀用无水乙醇洗1次， 10000g离心1-2min； ⑨　沉淀置于空气中3-5min，晾干后加～20 ?l无菌水溶解； DNA含量测定及电泳检测，琼脂糖浓度为0.8%。 取2-5?lDNA溶液稀释至100?l，于紫外核酸蛋白检测仪上 测定A260、A280的OD值，并计算DNA浓度得率。 纯的DNA的A260/A280在1.8左右。 注：核酸及其衍生物的紫外吸收高峰在260nm，在波长260nm紫外线下，1?g/mL的DNA溶液A260=0.020，1个OD值的光密度相当于双链DNA浓度为50?g/ml，单链DNA或RNA为40?g/ml，单链寡核苷酸为20?g/ml。 2. RAPD技术在生产上的应用-杂交水稻种子纯度的鉴定(RAPD 扩增) 一、实验原理 传统的种子纯度鉴定主要