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甲型流感病毒H1N1病例标本采集和实验室检测指南(暂行) 安徽省疾病预防控制中心 胡万富 2009.5.4 流感病毒有甲、乙、丙三种 至今甲型流感病毒已发现的血凝素有16个亚型(H1-H16),神经氨酸酶9个亚型(N1-N9) 猪流感是一种因甲型流感病毒引起的猪呼吸系统疾病 目前,已从猪身上分离到四种主要的亚型:H1N1、H1N2、H3N2和H3N1 甲型流感病毒H1N1亚型是目前疫情的主要病原体 临床标本的采集 采集对象:所有甲型流感( H1N1)疑似病例应该采集上呼吸道标本来检测猪进行H1N1病毒的相关检测 采集种类:鼻咽拭子/吸取物或者鼻腔冲洗液/吸取物。如果不能收集这些标本,可合并鼻拭子与口咽拭子。气管插管的病人也应收集气管吸取物。标本应置于无菌病毒运输液( VTM ),并立即用冰块或冰排保存或置于4 ℃(冰箱),并马上运送至实验室 采样器材要求 拭子:应使用头部为合成纤维的拭子(例如,聚酯纤维 ),用铝或塑料做杆。不推荐棉拭子和木杆。不能用海藻酸钙做的拭子收集标本。标本采集管应包含3毫升病毒运输液 采样管:外螺旋口、耐-70℃冻存 采样液:含有蛋白质稳定剂,阻止细菌和真菌生长的抗生素,缓冲液(可使用Hanks或Eagles等培养液加入抗菌素和0.5%BSA) 标本的储存和运送 临床标本储存 所有呼吸道标本应保存在4℃ ,并尽快放置在-70℃。如果没有-70℃度冰箱,标本应保存在4℃ ,但不应超过4天 临床标本运输 应按照A类包装要求进行样品的包装,所有标本应标示清楚。疑似病例标本运送应包含的信息请参照禽流感标本运输 标本运送方式 省内运送:公路运输,专人(2人)、专车 跨省运送:公路或航空 标本运送程序 实验室检测 方法: 1、首选Real-time RT-PCR方法检测 2、快速流感抗原检测 3、免疫荧光法 4、病毒分离 目前检测方法的评价 l?A型流感病毒的快速抗原检测可以用于检测该猪流感病毒,但由于和其它检测方法相比灵敏度较低,因此可能会导致假阴性结果。 l?由于免疫荧光和其他免疫检测方法中使用的抗体可能不会和该病毒的靶位点结合,因此会产生假阴性结果。 目前检测方法的评价 l?虽然在PCR方法中检测流感基因的高度保守片段和确诊A型流感的引物也许还可以使用,但目前PCR诊断试验中用于A型流感病毒分型的引物可能不能检测非人类病毒。 l?确诊猪流感病毒A/H1N1的唯一可靠的方法是进行病毒分离(病毒分离应在BSL-3实验室进行),并且至少进行部分基因测序。但阴性结果不能排除猪源流感病毒( A/H1N1 )感染 实验检测程序 1、流感快诊检测 区别甲、乙型流感病毒,乙型阳性排除,全部阴性结果不能排除 2、RT-PCR检测 针对猪源甲型流感病毒的特异性引物,人源甲型流感病毒引物不能有效地诊断猪源病毒感染 3、病毒分离 使用MDCK细胞、鸡胚可有效分离猪源病毒,对目前不能鉴定的甲型流感病毒株必须上送鉴定,在进行基因测序后可确定猪源病毒感染 甲型流感病毒(H1N1)PCR引物 SW Inf A: 目标片段大小 164 bp 5`-GCA CGG TCA GCA CTT ATY CTR AG-3` 5`-GTG RGC TGG GTT TTC ATT TGG TC-3` SW H1: 目标片段大小 115 bp 5`-GTG CTA TAA ACA CCA GCC TYC CA-3` 5`-CGG GAT ATT CCT TAA TCC TGT RGC-3` 检测实验室生物安全防护要求 生物安全防护原则 标本的检测、储存、包装和运送应按照《病原微生物实验室生物安全管理条例》(国务院424号令)和《可感染人类的高致病性病原微生物菌(毒)种或样本运输管理规定》(中华人民共和国卫生部第45号令)等有关规定执行 检测实验室生物安全防护要求 采集疑似感染A(H1N1)型猪流感病毒的患者临床标本、进行标本处理、包装、诊断性检测及进行病毒分离的工作人员必须进行严格的安全防护 所有的涉及病例标本的实验操作(包括样本的处理、包装及包装拆除)必须在生物安全柜内进行 检测实验室生物安全防护要求 临床标本的实验活动(病毒分离除外)必须在BSL-2实验室内进行 病毒分离、鉴定必须在BSL-3或更高一级的实验室内进行 检测实验室生物安全防护要求 推荐的个人防护装备(基于特定场所的风险评估) ·呼吸防护装备—检测合格的N95呼吸器或更高级别的防护装备。 ·鞋套 ·前封式手术服 ·双层手套 ·眼部防护装备(护目镜或面罩) 检测实验室生物安全防护要求 实验室废弃物处理原
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