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浙江大学研究生学位论文独创性声明啊人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为挟得浙江大学成其他教育机构的学位成 证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文 中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名:衔，中寻签字日期:2J (f 年乙月乙/日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解浙江大学有权保留并向回家有关部门戒机构 送交本论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权浙江大学可 以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索和传播，可以采用影印、 缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。(必威体育官网网址的学位论文在解密后适用本授权书)t学位论文作者签名: (1. 在 尊师签名:哆旷签字日期 : /f 年 L 月 Z I 日 签字日期: 7，，;? ( (年二月2斗日致谢论文收尾之际，回顾对我意义非凡的学习生液，内心激动之余，充满感激之情.衷心感谢我的导师严杰教授多年来给予的悉心指导和谆谆教诲，他一丝不苟的治学态度、宽广深厚的学术功底、敏锐的洞察力、以及勤奋执着的敬业精神，令 我非常敬佩，并将永远激励我今后努力学习和工作.非常感谢毛亚飞老师在研究过程中给予的悉心指导和帮助.感谢赵金方师姐 对本实验所做的大最、细致的指导工作，得以本实验顺利进行。感谢张成林、丁 士标、胡炜琳、赵欣及其他各位同学在学习过程中给予的无私帮助.从事科研工作是我从小就有的一个梦想.经过这段时间的工作经历，我再次 感受到了科研工作的最大魅力所在，也就是对未知事物的探索过程:从迷惑不解 与苦苦思索，到经历各种创新思维的多次挫败，最终获得理论和实践上的提高， 这是一个非常有意思的成长过程.在浙江大学实验室的科研经历，是我人生中最 有价值、最有意义的一段时光。最后特别要感谢我的父亲、母亲、爱人和女儿在我繁忙的学习过程中给予的 理解、支持和帮助，谨以本文献给他们。Alloferon 幡 1抗菌肤串联式重组表达及重组Alloferon 唰 1生物学活性研究 浙江大学医学院微生物学 同等学力硕士研究生徐小寅导师严杰教授中文摘要背景和目的恶性肿瘤是危及生命的人类重大疾病之一.目前除干扰素外， 临床上可使用的抗病毒药物抗病毒谱较窄并可诱导病毒耐药 l01. 抗菌肤 ( antibacterial peptide )是广泛存在于多种低等生物尤其是昆虫体内的规肤类物质， 有抵御外界微生物侵害、清除体内突变细胞作用的一类小分子多肤 [3·7}.AllohrOIl-l 是Chemysh 等 (2002 )从昆虫 Call伊hora vicina血液中发现的一种新型抗菌肤，体 外试验结果表明， Alloferon-1 可使小鼠脾脏内 NK 细胞活力显著增加，并促进干扰 素(lFN) 的合成与分泌。此外，针对肺部感染了致死剂景的人甲型和乙型流感病毒的小鼠， Alloferon-1 可显著地提高其存活率 {11. 鉴于Alloferon-l 分子量小 (13肤) 而难以诱生抗体、抗病毒和抗肿瘤效果明确、低剂量即能激活免疫系统的反应(问 级)等优点，故认为 Alloferon-l 较之其它抗菌肤，有更为明确的应用前景和优势， 将进一步发展成为既抗肿瘤又抗病毒的新型多肤类药物。本研究中，我们设计构 建了串联表达 14个以腆蛋白酶酶切位点赖氨酸连接的 Alloferon-l 原核表达系统，通 过对比重组表达的合赖氨酸尾巴的 Alloferon-1 及化学合成的 Alloferor 川的体外抗 肿瘤细胞活性，对重组 Alloferon斗的生物学活性进行了检测和研究.实验方法 根据Alloferon-l 氨基酸序列中不含精氨酸和赖氨酸的特点，将串 联表达的 Alloferon-l 设计为用腆蛋白酶切割.先设计合成一对交错互补的单链 DNA ，内含一个Allo岛ron-l 基因和一个赖氨酸密码子( Alloferor卜l-K基因)，在此 基础上再利用 DNA 复性的原理使其聚合成不同长度串联的 Alloferon-l-K 双链IIDNA. 将复性后串联的 A剑11ofer∞o卧n1卜卧--.川1川1再在PCR反应体系中使串联的 A川110仕úeron盼川.l斗 -K 双链DNA 两端的单链补齐，并在两端 连上A}:毛巴，然后将其克降到丁载体上;获得的阳性单克隆菌落经测序鉴定检测， 选取插入有 14 x A11oferonK 基因 T载体的单克隆并纯化其中的质粒 DNA 作为 PCR 模板，采用常规的分子生物学方法构建生产 14 x A11oferon 小K 的