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6 获得目的基因 6.1 化学合成法获得目的基因 6.2 PCR技术获得目的基因 6.3 筛选基因文库获得目的基因 6.4 转座子标签法获得目的基因 6.5 图位克隆法获得目的基因 6.6 mRNA差异显示技术获得差异表达的基因 6.7 生物信息技术分离和鉴定目的基因 6.1 化学合成法 适用于已知序列的小基因 6.1.1 亚磷酸三酯法 6.1.2 基因的组装 合成小片段后连接； 合成的单链寡聚体混合，局部退火配对，Klenow 酶合成互补链； 以上两种处理成粘性末端或平末端直接进行克隆。 6.2 PCR技术获得目的基因 6.2.1 PCR技术程序 高温变性（94度） 低温退火（50-60几度） 适温延伸（72度） 以上30-40几个循环，可将两引物间的特异片段扩增到106-107个拷贝。 6.2.2 PCR的反应体系 1 引物： （1）长度：18-24bp特异性最强。提高PCR产物的特异性可通过控制引物长度和退火温度实现。退火温度设置在Tm值（引物/模板的解链温度）附近。有时引物中需要添加一些与模板不配对的碱基，可在较低退火温度下进行4-5个循环，然后按正常的退火温度进行其余循环。 （2）引物的末端核苷酸 若有额外信息（如限制酶切位点）要加到引物中，在5′添加无关序列不会影响特异序列的退火。引物3′末端保守性强，其序列对PCR的成功非常关键，如能确定一个保守氨基酸，则可将其密码子的前2个碱基作为3 ′，若是单一密码子编码氨基酸，则三个碱基均可，引物3 ′末端如果同模板完全配对，可获得好结果， 3 ′末端的最后的5-6个核苷酸应尽可能避免错配。 （3） 防止引物的同源互补 引物间和引物内不能互补，如果互补会导致引物二聚体出现，这样的PCR产物是引物自身的扩增，会在引物二聚体产物和天然模板间产生竞争进行PCR的状态，从而影响扩增效率。当反应体系中加入多对引物，应对所有引物进行交叉配对检验。可通过计算机软件进行分析检测，避免引物间和引物内的互补配对。 （4）合适的GC含量和Tm值 引物应保持合理GC含量。G+C含量在50%的20nt引物的Tm值约在56-62度范围内。一对引物间的GC含量要相似，使它们可在相近的温度下与互补序列结合； 对于小于25nt的引物，退火温度可用下式计算：Tm=2(A+T)+4(G+C) 一般选用过低退火温度导致特异性下降，错误引发PCR；选用过高退火温度会导致引物不易与目的基因互补，退火无效。 （5）也可使用引物设计软件 使用引物设计软件时要限定严格的寻找参数，这样才能有更快的寻找速度和得到更高质量的引物。 PCR反应系统中引物的设计原则： 引物长度15-30bp；碱基随机分布，G+C含量45-55%；引物内部不能形成二级结构，两引物间不能互补；可在5′端加保护碱基或酶切位点序列；引物3′高度保守，碱基选T、C、G，不选A，有利于延伸。 2 Taq 酶 最早的PCR反应用Klenow 酶，热稳定性差，每一轮变性和退火后须加新酶； TaqE耐热，使热循环自动化操作成为可能；TaqE无3′-5′外切校正功能，错误掺入率为 2×10-4 ，聚合完成后会在3′端加非模板互补的A, 克隆时用T-Vector； 已生产出高保真具校正功能的DNA聚合酶：Vent、Deep、Tli、Pwo、Pfu、UTTma，错误掺入率可降低到 1 × 10-6 。 3 反应缓冲液 主要成分： 10-50 mmol/L Tris-HCl 50 mmol/L KCl 1.0-2.5( 常用1.5) mmol/L MgCl2 Mg 2+浓度影响Taq酶的活性及精确性、引物退火程度、模板的解链温度、产物的特异性、引物二聚体的形成。 6.2.3 特殊PCR技术获得目的基因 应用PCR技术克隆基因组DNA和cDNA PCR以其灵敏、快速和自动化等优点广泛应用于基因工程研究，可利用特异引物的PCR直接从基因组DNA中克隆基因。然而典型PCR所需条件的限制使之仅对较短产物扩增有效，一般为1-2kb，最大5kb，反映了Taq酶持续合成能力的不足和校正能力的缺乏，这些缺陷增加了酶从模板上脱离的可能性，特别当目的序列较长时更如此；另外，PCR特殊的反应条件可能对碱基造成损伤，在DNA 链上产生缺口，也增加了扩增提前终止的可能性。 1 长PCR 可联合使用两个酶（聚合酶和校正酶），提高使用长模板PCR的效果，校正酶可清除Taq 酶延伸过程中错配的碱基，而一般情况下缺少校正活性使扩增中断。用