SDS-PAGE电泳法测蛋白质分子量.docVIP

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SDS-PAGE电泳法测蛋白质分子量

1.样品溶液中各种试剂的作用是什么? SDS:使蛋白质变性剂能与样品蛋白结合,使样品蛋白质都带负电荷显棒状,消除了电荷和分子形状对相对分子质量的测定的影响,从而可利用相对分子质量差来分离蛋白。 巯基乙醇促凝作用,加速聚丙烯酰胺的凝固可以让蛋白下沉到点样孔底部,防止漂样还有指示剂的作用可以让蛋白下沉到点样孔底部,防止漂样作为指示剂,因为溴酚蓝呈蓝色,而蛋白质是白色,在SDS-凝胶中不明显,且溴酚蓝的相对分子量比蛋白质(绝大部分)小,电泳时速度比蛋白质稍快,因此当溴酚蓝到达电泳槽底部(可看蓝色调带),则电泳结束。 电泳应尽可能在恒温条件下进行。选用一定pH 的缓冲液。同时,所选用的pH 以密扩大各种被分离物质所带电荷量的差异为好,以利于分离各种成分。有效迁移率还受电渗现象的影响,电泳时应避免用高电渗物质作支持介质。凝胶孔径的不连续性、缓冲液离子成分的不连续性、pH的不连续性及电位梯度的不连续性先使进入柱胶的样品在浓缩胶中逐渐浓缩、在上下胶层界面上最终被压缩成很薄的样品区带,进入分离胶后再进行组分的分离,形成最终的分离区带。根据分离胶缓冲液pH值高低,有3种操作系统,分别为碱性系统、酸性系统和中性系统 由于浓缩胶的孔径比较大,分离胶的孔径较小所以蛋白质在浓缩胶中快速运动,到分离胶时速度变慢,就被

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