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第三章 分子克隆载体 接合型质粒（conjugative plasmid）：除了具有自主复制所必须的遗传信息之外，还带有一套控制细菌配对和质粒接合转移的基因。 非接合型的质粒（non-conjugative plasmid ）：具有自主复制的遗传信息，但失去了控制细胞配对和接合转移的基因，因此是不能从一个细胞自我转移到另一个细胞 α -互补：现在使用的许多载体都带有一个E.coli DNA的短区段，其中含有β-半乳糖苷酶的-α肽基因（lacZ’）的调控序列和头146个氨基酸的编码信息。这个编码区中插入了一个MCS，它并不破坏读框，但是可使少数几个氨基酸插入到β-半乳糖苷酶的氨基端而不影响功能，这种载体适用于编码β-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞，虽然宿主和质粒编码的片段各自都没有酶活性，但它们可融为一体，形成具有酶活性的蛋白，从而实现互补，这种现象称为~。 由α -互补而产生的Lac+细菌容易识别，它们可在X-gal和IPTG存在下形成兰色菌落，但外源DNA插入到质粒的MCS后，则会产生无α -互补能力的氨基端片段，故带有重组质粒的细菌形成白色菌落。 第四章 人工染色体载体 Saccharomyces cerevisiae 酿酒酵母 扁圆形和卵形 ；直径3μm； 代时 90min； 16条染色体 ； 300-2000kb； 14×106bp； 具真核mRNA的加工活性。 一、酵母人工染色体载体 （yeast artificial chromosome） 酵母的生物学特征： YAC（yeast artificial chromosome）克隆载体是最早构建成功的人工染色体克隆载体，能像染色体一样在酵母细胞中正常的复制。它是以pBR322为骨架建立，带有pBR322的复制起点ori和筛选标记基因Ampr，另外还加入作为酵母chr.所必须的一些成分： 一段来自酵母chr.的着丝粒序列（能在细胞分裂过程中将chr.载体均匀的分配到子细胞中） 一段控制酵母chr.复制的自主复制序列（ARS） 一对酵母的端粒序列（来自四膜虫chr.），防止chr.载体与其他chr.相互粘连，并避免在DNA复制过程中造成基因的缺失，从而保证了chr.载体在细胞分裂和遗传过程中的相对独立和稳定。 选择标记TRP1和URA3（酵母Trp和U营养缺陷型的野生型等位基因） 克隆位点存在于酵母酪氨酸tRNA基因赭石突变的校正基因Sup4中。 常用的YAC克隆载体：pYAC3、 pYAC4 和pYAC5，其差别在于Sup4基因上的克隆位点不同。 基因组DNA与YAC臂体外连接过程中产生嵌合体； 通过共转化导入同一个酵母原生质体的不同YAC克隆的有丝分裂重组也会产生嵌合体； 染色体DNA操作困难。 缺点： Cavalli-Sforza（1950）和Hayes（1952）； E.coli接合交配期染色体标记的单向转移； 大小约100kb，编码60多种参与复制、分配和接合过程的蛋白质； 可以整合到宿主染色体中，在E.coli染色体中有30多个位点进行随机整合。 二、细菌人工染色体载体 （bacterial artificial chromosome） F质粒： 自然发生的F因子能携带1/4的大肠杆菌染色体而不显张力或不稳定； 拷贝数低（1 ）：有助于减少DNA分子间重组，保证文库转化子生长平衡，减小对受体菌的毒副作用。 F质粒改造成载体的设想： P1噬菌体：P1噬菌体是与λ噬菌体同年（1951）被发现的。从感染性P1颗粒提取DNA大小约110kb，为双链、线状、末端冗余且环状变化（34bp loxP）的DNA。 三、P1载体和PAC载体 基于P1噬菌体构建 P1噬菌体载体构建DNA文库流程图 第五章 表达载体 大肠杆菌表达载体 穿梭载体 整合载体 第一节 大肠杆菌表达载体 一、大肠杆菌表达载体的结构 启动子（promoter） 终止子（terminator） 核糖体结合位点（RBS） 二、表达载体中启动子的种类和原理 Plac 启动子 Ptac 启动子 T7启动子（T7噬菌体） PL启动子（λ噬菌体） 二、λ噬菌体载体 1、λ噬菌体的性质 λ DNA：λ噬菌体由DNA和外壳蛋白组成。λ噬菌体分头部和尾部，λDNA集中在头部。λDNA在噬菌体中是线状，全长48502bp，左右各有12个核苷酸组成的5’凸出粘性末端（cohesive end），且两者互补。进入宿主细胞后，粘性末端连接成为环状DNA分子，这样能连接的末端称为cos位点。 5’GGGCGGCGACCTNN……NN3’ 3’NN……NNCCCGCCGCTGGA