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第三部分 基因克隆在生物技术中的应用 chapter 12 蛋白质工程 生物技术可以追溯到4000年前，新石器时代的晚期，利用发酵过程生产蜂蜜酒。 20世纪，微生物生物技术得到了广泛的发展。 1927年，Alexander Fleming发现Penicillium能够合成青霉素。 1 大肠杆菌的表达载体 基因的表达依赖于基因周围的一组信号： promoter: Teminator：转录结束的位点，终止子 核糖体结合位点： 1 大肠杆菌的表达载体 将外源基因插入载体中，使其处于一系列的E. coli表达信号的控制之下。克隆载体提供了表达的信号，所以可以用来生产重组蛋白，被称为表达载体。 1.1 启动子 启动子是表达载体的最重要的组成成分，决定了mRNA合成的速度。 所有的E. coli启动子都有两个保守序列，保守序列的变化是影响转录效率的主要因素。 1.1 启动子 启动子的选择 在E. coli有两种主要的调控方式： 诱导：加入底物后基因的表达才能启动。 抑制：加入调控物后表达被关闭。 1.1 启动子 启动子的选择 重组蛋白可能对细菌有害，其合成必须控制在毒性水平之下。 持续的高水平表达影响重组质粒的复制，最终导致表达产物的下降。 1.1 启动子 表达载体应用的启动子 lac启动子：控制编码β-乳糖苷酶的lacZ基因转录的序列，可被IPTG诱导。 1.1 启动子 表达载体应用的启动子 trp启动子：色氨酸启动子可以被色氨酸抑制，也可被3-β-吲哚丙烯酸诱导。 1.1 启动子 表达载体应用的启动子 tac启动子：是lac和trp启动子的杂交分子，比两者都要强，同样可以被IPTG所诱导。 1.1 启动子 表达载体应用的启动子 λPL启动子：是负责λDNA分子转录的启动子之一。可被λcI基因产物所抑制。载体使用温度敏感的E. coli cI突变体。 在较低的温度下，cI蛋白可以抑制 λPL启动子，在较高的温度下，导致克隆基因的转录。 1.2 Cassettes和基因融合 高效的表达载体不仅需要可调控的强启动子，而且需要E. coli核糖体的结合位点序列和终止子。在表达载体中，这些表达信号组成一个cassette(盒）。 1.2 Cassettes和基因融合 盒式载体中，外源的基因在一段E. coli基因之后。外源基因的插入必须能够融合两个阅读框架的方式进行。 基因的表达产物是一个蛋白质的杂交分子，包含E. coli阅读框架编码的短肽和外源基因蛋白。 1.2 Cassettes和基因融合 E. coli片段的存在可能改变重组蛋白的特性，需要切去细菌的片段。 结合点是蛋氨酸，可以通过溴化氰切开。 凝血酶等酶可以在精氨酸处切开。 Factor Xa可以在Gly-Arg后切开多肽。 另外还要注意，所用的试剂不会在重组分子内部切开分子。 2 E. coli重组蛋白的限制 外源基因的序列 E. coli不能正确加工合成的重组蛋白 2.1 外源基因序列导致的问题 主要有3个因素： 外源基因可能含有内元 外源基因可能含有在E. coli作为终止子的序列 偏爱的密码子：表现在tRNA识别不同密码子的效率不同。 2.1 外源基因序列导致的问题 解决问题的方法： 克隆的基因含有内元，可以使用mRNA。 定点突变的方法改变可能的终止序列。 用E. coli偏爱的密码子。 小于2kb的基因利用化学合成的片段来代替，使用E. coli偏爱的密码子，并保证不会有提前存在的终止序列。 2.2 E. coli产生的问题 在E. coli中合成的蛋白不能正确的糖基化。 E. coli不能正确的折叠蛋白。蛋白不能进行正确的折叠，使三级结构不溶，在细菌中形成内含体。 E. coli可能降解重组蛋白。 2.2 E. coli产生的问题 解决方法： 重组蛋白降解的问题可以使用一个或多个蛋白酶突变E. coli来解决。 正确折叠也可以通过选择特异的寄主品系来解决，某些品系可以过量的合成与折叠有关的伴侣蛋白。 2.2 E. coli产生的问题 糖基化的问题无法解决。只有不需要糖基化的蛋白可以利用这种途径合成。 3 利用真核生物合成重组蛋白 酵母、丝状真菌 动物细胞 植物表达系统 3.1 真菌表达系统 酵母和丝状真菌 可能具有更高的合成重组蛋白的能力 容易培养 蛋白加工能力 3.1.1 酿酒酵母 S. cerevisiae仍然是应用最广泛的生产重组蛋白的真核微生物。 它是在医药和食品工业中安全的一种生物体 S. cerevisiae的生化和遗传研究已经非常详细。 3.1.1 酿酒酵母 酿酒酵母S. cerevisiae是目前生产重组蛋白最普遍的真核微生物。 S. cerevisiae不能正确的糖基化动物蛋白，也不能将产生的蛋白分泌到培养基中。 偏爱密