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PLFAs测定操作规程 仪器设备： 名 称 规 格 数 量 用 途 烘箱 ** 1 测定土壤含水量 冷柜 4℃ 1 暂存土壤样品 冷柜 -20℃ 1 用于土壤样品的长期保存 2-3 内待检测样品的保存 冷柜 -80℃ 1 3 以上待检测样品的保存 通风橱 中 1 试验各步骤均需在通风橱中进行 分析天平 1/10000（0.0001 g） 1 称样 测定含水量 振荡器 可调速 1 提取 超速离心机 最高转速＞5000 r/min 1 提取 氮吹仪 DC-12 1 浓缩提取液 萃取收集器 Supelco Visiprep DL 24位防交叉污染固相萃取装置 1 纯化（获取PLFA） 真空泵 循环水式真空泵 SHZ-D（III） 1 加速淋洗速度 水浴锅 恒温 1 甲醇分解 微量加样枪 200 uL 1 移液 微量加样枪 500 uL 1 移液 微量加样枪 1 mL 1 移液 微量加样枪 5 mL 1 移液 移液瓶 6 mL 1 移液 移液瓶 12 mL 2 移液 移液瓶 23 mL 1 移液 实验耗材: 名 称 规 格 数 量 用 途 铝盒 中号 24 测定含水量 离心管 50 mL 24 提取 分液漏斗 250 mL 24 萃取样品溶液的酯类物质 大试管A 35 mL 24 盛装分液漏斗分离的总酯提取液 大试管B 10 mL 24 盛装经萃取小柱分离的PLFA甲醇溶液 大试管C 5 mL 24 盛装甲醇分解后的PLFA甲酯溶液 萃取小柱 3 mL/6 mL 24 纯化PLFA 枪头 5 mL 10 移液 枪头 1 mL 5 移液 枪头 500 uL 30 移液 枪头 200 uL 60 移液 丙腈橡胶手套 中号 2 实验操作时须戴 橡胶手套 厚 2 清洗容器时须戴 纱布 卷 1 罩容器试剂瓶时用 注：数量以24个样品计。 实验试剂： 名 称 规 格 最 低 用 量 正己烷 分析纯 120 mL 三氯甲烷 分析纯 840 mL 甲醇 优级纯 720 mL 丙酮 优级纯 240 mL 甲苯 优级纯 12 mL 氢氧化钾 优级纯 24 mL 0.2M KOH 醋酸 优级纯 7.2 mL 1M CH3COOH 磷酸 优级纯 530 mL 超纯水 48 mL 注：数量以24个样品计 未计清洗用量和配试剂用量。 试 剂: 1、磷酸缓冲液[c(K2HPO4) = 0.05 mol·L-1]：向38.84 g K2HPO4加入12 mL CHCl3，再加入超纯水稀释到4000 mL； 2、提取液[v（甲醇）：v（三氯甲烷）：v（磷酸缓冲液）= 2 : 1 : 0.8]：526 mL CH3OH加入263 mL CHCl3和210 mL 磷酸缓冲液； 3、甲醇甲苯混合液[v（甲醇）：v（甲苯）：=1 : 1]：取100 mL 甲醇和100 mL 甲苯混合； 4、甲基化醋酸[c(CH3COOH) =1 mol·L-1]：4.60 mL CH3COOH加入80 mL 超纯水； 5、甲基化氢氧化钾[c(KOH) =0.2 mol·L-1]：28.05 g KOH加超纯水定容至1000 mL为0.5 M KOH溶液，再取40 mL 0.5 M KOH溶液加入60 mL CH3OH为0.2 M KOH溶液。 PLFAs提取操作流程： 实验前准备工作 1、土壤过2 mm 筛，用镊子捡出根、凋落物碎屑及小石块； 2、20 g左右土壤样品置于铝盒中，称铝盒+鲜土重 105℃烘干，称铝盒+干土重 计算土壤含水量 3、配制试剂，准备实验用品。 注意：所有玻璃器皿（试管、小瓶及瓶盖等）在实验前均须用正己烷润洗，晾干； 实验操作时必须戴丙腈橡胶手套。 称取相当于8 g干重的土壤，置于35 mL离心管中 向离心管中加入5 mL磷酸缓冲液（用5 mL移液枪，将含水量计入） 再加入6 mL三氯甲烷，12 mL甲醇（用移液瓶） 25℃，3500 rmin，离心10 min ⑦ 加入23 mL提取液于离心管中的剩余土壤中重复 ⑧ 摇床振荡30 min⑨ 25℃，3500 rmin，离心10